一种神经母细胞瘤类器官培养基和培养方法技术

本发明专利技术公开了一种神经母细胞瘤类器官培养基以及培养方法，涉及类器官培养技术领域。该培养基成分包括DMEM/F12、Penicillin/Streptomycin、GlutaMax、NEAA、B

【技术实现步骤摘要】
一种神经母细胞瘤类器官培养基和培养方法


[0001]本专利技术涉及类器官培养
，具体而言，涉及一种神经母细胞瘤类器官培养基以及培养方法。

技术介绍

[0002]神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体肿瘤。神经母细胞瘤具有较强的异质性，生物学行为复杂、恶性程度高，易复发转移，在因肿瘤致死儿童中占15％。迄今为止，神经母细胞瘤的研究局依赖种类有限的细胞系以及异种移植模型。研究中广泛使用的神经母细胞瘤细胞系(如SK
‑
N
‑
Be(2)以及SK
‑
N
‑
SY5Y等)由于长期的体外培养，已经失去部分患者体内的生物学特征。而异种移植模型则限于成本高昂、培养周期长以及培养成功率的问题，难以普遍应用于研究领域。因此，建立一种较为经济、与神经母细胞瘤患者临床特征更为接近的模型，能够为神经母细胞瘤的机制研究以及药物开发测试提供理想模型。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于克服上述现有技术不足之处，提供一种神经母细胞瘤类器官培养基以及培养方法。本专利技术提供的培养基能够提高神经母细胞瘤类器官的培养成功率，所培养得到的神经母细胞瘤类器官能够良好地维持来源肿瘤组织的遗传学特征，进而能够更好地模拟神经母细胞瘤的生物学特性，为筛选神经母细胞瘤的更有效治疗药物提供更可靠的模型基础。
[0004]肿瘤类器官是一种取材于人体离体肿瘤组织并且通过模拟体内环境在体外培养而获得的可独立生长的离体组织。其利用基质胶或水凝胶来模拟细胞外基质，给肿瘤细胞提供3D支架；并通过外来添加的小分子、生长因子等物质，模拟人体体内环境，以得到最接近人体来源肿瘤各项生物学特征和理化性质的组织。类器官研究相对于目前研究中常采用的细胞系试验和动物实验，具有更好地亲代相似性和个体化特征，在各种临床机制研究和药物筛选研究中具有更广泛的应用前景。
[0005]本专利技术的专利技术人在研究中发现，采用某些方法培养得到的神经母细胞瘤类器官生长较为缓慢，后续应用于药物筛选时存在时效性长的问题，不能满足临床需求。此外，这些方法培养得到的类器官突触增多，细胞呈现分化趋势，不能很好地模拟神经母细胞瘤原生组织的特性，丢失了神经母细胞瘤肿瘤细胞所携带的肿瘤干性，对后续的类器官传代扩增带来了不利的影响。经过专利技术人的不懈努力和创造性研究，发现培养基中的FBS是影响神经母细胞瘤类器官特征的重要因素。
[0006]基于此，第一方面，本专利技术提出一种用于神经母细胞瘤类器官培养的培养基，其包括基础培养基、以及添加在所述基础培养基中的抗菌成分以及添加因子；所述基础培养基为DMEM/F12，所述抗菌成分为Penicillin/Streptomycin，所述添加因子包含GlutaMax、NEAA、B
‑
27、N
‑
2、EGF、bFGF、β
‑
mercaptoethanol以及LIF，所述培养基不含FBS。
[0007]本专利技术所述培养基不含FBS，并合理调控其他组分的添加，可专门用于神经母细胞
瘤类器官的培养基，能够有效的建立神经母细胞瘤类器官以及长期的培养扩增，7天左右即可获得所需神经母细胞瘤类器官，得到神经母细胞瘤类器官能够良好地维持来源肿瘤组织的遗传学特征，进而能够更好地模拟神经母细胞瘤的生物学特性，为筛选神经母细胞瘤的更有效的治疗药物提供更可靠的模型基础。
[0008]目前关于神母细胞瘤类器官培养的文献报道较少，且包含的样本例数不多。故神经母细胞瘤类器官的培养方法，如组织细胞提取流程、神经母细胞瘤类器官培养基以及培养条件目前均尚未有太多研究。因此，本专利技术实施例提供的培养基和培养方法，经济、高效以及稳定的神经母细胞瘤类器官模型，能够有力地推进神经母细胞瘤的机制研究和药物开发。
[0009]其中，Penicillin/Streptomycin，即青霉素与链霉素混合物，是细胞培养常用试剂，能够用于防止类器官培养受到细菌污染。
[0010]GlutaMax，即谷丙氨酸二肽添加物，能够作为所培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢，促进类器官细胞生长；
[0011]NEAA(Non
‑
Essential Amino Acids)，即非必需氨基酸添加剂，能够提供类器官中细胞生长代谢所需的非必需氨基酸；
[0012]B
‑
27添加剂(B
‑
27为Thermo
‑
Fisher公司产品，B
‑
27是商品名，包含维生素H、维生素E、胰岛素、转铁蛋白、过氧化物歧化酶以及过氧化氢酶等生物素及蛋白，本专利技术实施例使用的货号为12587010)，是一种神经元细胞培养添加剂，既往研究中用于各类人源组织中的神经元细胞培养；在本专利技术类器官培养基中用于促进神经母细胞瘤类器官的生长；
[0013]N
‑
2(N
‑
2为Thermo
‑
Fisher公司产品，N
‑
2是商品名，包含胰岛素、转铁蛋白、黄体酮、丁二胺、亚硒酸盐等物质，本专利技术实施例使用的货号为17502048)添加剂与B
‑
27添加剂类似，能够促进原代神经母细胞的生长；在本专利技术类器官培养基中用于促进神经母细胞瘤类器官的生长；
[0014]EGF(Epidermal growth factor)，即表皮生长因子，能够刺激各种上皮细胞增殖，在本专利技术类器官培养基中用于促进神经母细胞瘤类器官的生长；
[0015]bFGF(fibroblast growth factor basic)，即基础成纤维细胞生长因子，与多种生物过程有关，如肢体、神经系统发育和肿瘤生长，在本专利技术类器官培养基中用于促进神经母细胞瘤类器官的生长；
[0016]β
‑
mercaptoethanol，即β
‑
巯基乙醇，够清除羟基自由基等，可作为生物抗氧化剂，在本专利技术类器官培养基中用于维持神经母细胞瘤类器官的生长环境稳态；
[0017]LIF(Leukemia Inhibitory Factor)，即白血病抑制因子，是一种多营养因子，能够通过抑制自发分化促进胚胎干细胞的长期维持，在本专利技术类器官培养基中用于抑制神经母细胞瘤类器官的分化趋势，维持类器官的细胞干性。
[0018]可选地，在一些实施方案中，所述添加因子中各组分在所述基础培养基中的终浓度如下：GlutaMax 1％、NEAA 1％、B
‑
27 2％、N
‑
2 1％、EGF 0.01～0.1μg/mL、bFGF 0.01～0.1μg/mL、β
‑
mercaptoethanol 0.01～0.1mM以及LIF 100～104U/mL。
[0019]其中，EGF的终浓度可以是0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、和0.1μg/mL之中的任一者或任本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于神经母细胞瘤类器官培养的培养基，其特征在于，包括基础培养基、以及添加在所述基础培养基中的抗菌成分以及添加因子；所述基础培养基为DMEM/F12，所述抗菌成分为Penicillin/Streptomycin，所述添加因子包含GlutaMax、NEAA、B
‑
27、N
‑
2、EGF、bFGF、β
‑
mercaptoethanol以及LIF，所述培养基不含FBS。2.根据权利要求1所述的用于神经母细胞瘤类器官培养的培养基，其特征在于，所述添加因子中各组分在所述基础培养基中的终浓度如下：GlutaMax 1％、NEAA 1％、B
‑
27 2％、N
‑
2 1％、EGF 0.01～0.1μg/mL、bFGF 0.01～0.1μg/mL、β
‑
mercaptoethanol 0.01～0.1mM以及LIF 100～104U/mL。3.根据权利要求1或2所述的用于神经母细胞瘤类器官培养的培养基，其特征在于，所述添加因子中的如下组分在所述基础培养基中的终浓度如下：EGF 0.02μg/mL、bFGF 0.04μg/mL、β
‑
mercaptoethanol 0.05mM以及LIF 103U/mL。4.根据权利要求1或2所述的用于神经母细胞瘤类器官培养的培养基，其特征在于，所述添加因子中的如下组分在所述基础培养基中的终浓度如下：EGF 0.1μg/mL、bFGF 0.1μg/mL、β
...

【专利技术属性】
技术研发人员：董瑞，詹镛，戴菽阳，杨然，李仪，
申请(专利权)人：上海晟燃生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：