一种肾小球内皮细胞完全培养基及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种肾小球内皮细胞完全培养基及其制备方法和应用，属于细胞培养技术领域。该肾小球内皮细胞完全培养基包括以下组分：基础培养基、血清、肝素钠、维生素C、氢化可的松、谷氨酰胺、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子和霍乱毒素。使用该肾小球内皮细胞完全培养基能有效提高肾小球内皮细胞的增殖能力，并保持细胞形态和性状，培养至P4代时，细胞依然生长旺盛，细胞纯度可达到90％以上。细胞纯度可达到90％以上。细胞纯度可达到90％以上。

【技术实现步骤摘要】
一种肾小球内皮细胞完全培养基及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种肾小球内皮细胞完全培养基及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]肾小球内皮细胞是肾小球固有细胞之一，也是构成肾单位的重要组成部分。肾小球内皮细胞能够调节肾小球滤过功能，是滤过屏障内壁的重要组成部分，与肾小球的病理生理过程相关。肾小球内皮细胞直接与血液相接触，是血液中各种病理生理因素作用的自然靶细胞，参与肾小球基膜有关成分的合成与修复，在调控肾小球内凝血、免疫反应和炎症过程中起重要作用。肾小球内皮细胞还可结合凝血因子IXa、因子Xa，合成并释放凝血因子VIII、血管紧张素转换酶，转化生长因子
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β及其受体、血管内皮生长因子及其受体、血管生成素受体Tie
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2、内皮素及其受体、内皮源性舒张因子以及胰岛素受体等。肾小球内皮细胞的培养已成为新药筛选、疾病发病机制的研究、药物靶向治疗等领域的研究热点。
[0003]内皮细胞体外培养对于培养基营养要求较高，而提高生长速度、增加传代次数和维持传代后细胞性状对于利用内皮细胞在体外研究多种疾病的显得尤其重要。目前市场上比较成熟的内皮细胞培养基主要有Lonza公司的EGM和EGM
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2系列，以及Sciencell的ECM培养基，上述培养基在体外培养内皮细胞都有相对不错的效果，但配方保密且价格昂贵。中国专利CN105969720B公布了一种人类血管内皮细胞培养液及其培养方法。该人类血管内皮细胞培养液包含基础培养基、胎牛血清、人重组表皮生长因子、人重组成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、维生素C、皮质醇、霍乱毒素、氨基乙醇及磷酸乙醇胺。该人类血管培养基相对于传统血管内皮细胞培养基，能够适用于多种血管内皮细胞，减少分裂时间，增加了体外人类血管内皮细胞的传代数和生存时间。CN104974978B公布了一种内皮细胞培养基及内皮细胞的培养方法，该内皮细胞培养基包括无血清基础培养基、胰岛素、转铁蛋白、维生素C、牛血清白蛋白、碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子、干细胞生长因子、层粘连蛋白、表皮生长因子、非必须氨基酸和二甲双胍盐酸盐。该内皮细胞培养基用于培养血管内皮细胞能够提高细胞的增殖能力。专利申请文本CN110923205A公布了一种淋巴管内皮细胞培养基及其制备方法和用途。该淋巴管内皮细胞培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂包括：胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子、维生素C、转铁蛋白、牛血清白蛋白、皮质醇、青霉素和链霉素。该淋巴管内皮细胞培养基能够有效促进淋巴内皮细胞的增殖，在体外扩充了8代以后，细胞仍能有较大程度维持原有性状，延长了生存时间。
[0004]然而，不同来源(包括不同部位、不同种属)的内皮细胞之间的功能和形态存在异质性。例如，毛细血管内皮细胞多连接紧密而无孔隙，但肾小球内皮细胞可见较多孔隙；脑部的毛细血管内皮细胞可见较大基底核和丰富的细胞浆、染色质分布疏松不致密，脾窦内皮细胞基底核则较小、仅见少量细胞浆、染色质分布致密。即使来自同一组织的内皮细胞也有区别。例如，视网膜中间部分培养的内皮细胞可见细胞密集、细胞内无有丝分裂活动，与
在体的视网膜内皮细胞特性一致；而视网膜边缘部分培养的内皮细胞与中间部分培养的内皮细胞有明显区别，可见有丝分裂活动且细胞分布稀疏。一些内皮细胞生长因子作用于不同的内皮细胞后，可引起不同的细胞内信号转导通路。例如，肝细胞生长因子作用于人脐静脉和牛主动脉内皮细胞后，人脐静脉内皮细胞可检测到磷酸化的p38和p44/42丝裂原活化蛋白激酶，但牛主动脉内皮细胞只能检测到磷酸化的p44/42丝裂原活化蛋白激酶。
[0005]因此，肾小球内皮细胞与血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞虽然均为内皮细胞，但细胞功能和生长条件并不相同(Haraldsson B,JThe glomerular endothelium:new insights on function and structure[J].Current Opinion in Nephrology&Hypertension,2012,21(3):258
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63.)，上述现有技术中公开的培养基并不能完全适合肾小球内皮细胞的培养需要。故寻找稳定性好、成本低的肾小球内皮细胞专用培养基，成为深入研究和应用肾小球内皮细胞的必要前提，对于利用肾小球内皮细胞进行体外研究多种疾病显得尤其重要。

技术实现思路

[0006]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种肾小球内皮细胞完全培养基，该完全培养基用于培养肾小球内皮细胞时，能够提高肾小球内皮细胞的增殖和传代能力。
[0007]具体地，本专利技术采用如下技术方案来实现：
[0008]一种肾小球内皮细胞完全培养基，包括以下组分：基础培养基、血清、肝素钠、维生素C、氢化可的松、谷氨酰胺、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子和霍乱毒素。
[0009]优选地，所述肾小球内皮细胞完全培养基包括以下组分：基础培养基、占所述基础培养基5％～10％体积的胎牛血清、50
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60μg/mL肝素钠、1～2μg/mL维生素C、0.1～1μg/mL氢化可的松、0.1～1mg/mL谷氨酰胺、10～20ng/mL表皮生长因子、10～20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10～20ng/mL胰岛素样生长因子、0.1～1ng/mL血管内皮生长因子和0.5～5ng/mL霍乱毒素。
[0010]进一步优选地，所述肾小球内皮细胞完全培养基包括以下组分：基础培养基、占所述基础培养基5％体积的胎牛血清、58μg/mL肝素钠、2μg/mL维生素C、0.2μg/mL氢化可的松、1mg/mL谷氨酰胺、13ng/mL表皮生长因子、15ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、20ng/mL胰岛素样生长因子、0.5ng/mL血管内皮生长因子和3ng/mL霍乱毒素。
[0011]优选地，所述无血清基础培养基为MCDB131培养基或M199培养基。
[0012]本专利技术进一步提供了所述肾小球内皮细胞完全培养基的制备方法，包括以下步骤：
[0013]Q1、向所述基础培养基中依次加入所述肝素钠、维生素C、谷氨酰胺，室温下搅拌10min，得到第一培养基；
[0014]Q2、将所述氢化可的松、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子和霍乱毒素混合均匀后加入所述第一培养基中，得到第二培养基；
[0015]Q3、将所述血清加入所述第二培养基中，混合均匀，用0.2μm PVDF滤膜过滤除菌，得到肾小球内皮细胞完全培养基。
[0016]本专利技术还提供了所述肾小球内皮细胞完全培养基用于培养肾小球内皮细胞的方
法，包括以下步骤：
[0017]S1、将肾小球内皮细胞离心，将得到的细胞沉淀加入所述肾小球内皮细胞完全培养基中，培养，得P1代细胞；所述离心的条件为以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肾小球内皮细胞完全培养基，其特征在于，包括以下组分：基础培养基、血清、肝素钠、维生素C、氢化可的松、谷氨酰胺、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子和霍乱毒素。2.根据权利要求1所述的肾小球内皮细胞完全培养基，其特征在于，包括以下组分：基础培养基、占所述基础培养基5％～10％体积的胎牛血清、50
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60μg/mL肝素钠、1～2μg/mL维生素C、0.1～1μg/mL氢化可的松、0.1～1mg/mL谷氨酰胺、10～20ng/mL表皮生长因子、10～20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10～20ng/mL胰岛素样生长因子、0.1～1ng/mL血管内皮生长因子和0.5～5ng/mL霍乱毒素。3.根据权利要求2所述的肾小球内皮细胞完全培养基，其特征在于，包括以下组分：基础培养基、占所述基础培养基5％体积的胎牛血清、58μg/mL肝素钠、2μg/mL维生素C、0.2μg/mL氢化可的松、1mg/mL谷氨酰胺、13ng/mL表皮生长因子、15ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、20ng/mL胰岛素样生长因子、0.5ng/mL血管内皮生长因子和3ng/mL霍乱毒素。4.根据权利要求1所述的肾小球内皮细胞完全培养基，其特征在于，所述基础培养基为MCDB131培养基或M199培养基。5.权利要求1～4任一项所述的肾小球内皮细胞完全培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：Q1、向所述基...

【专利技术属性】
技术研发人员：冷毅斌，吴亭，刘浩，黄晓芸，
申请(专利权)人：武汉普诺赛生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：