皮肤模型及其制备方法、对化合物检测的方法技术

本发明专利技术提供一种皮肤模型及其制备方法、对化合物检测的方法，属于体外三维组织培养技术领域。皮肤模型包括：从上到下依次设置的表皮层与真皮层；表皮层包括角质细胞；真皮层包括水凝胶以及均匀掺杂在水凝胶中的成纤维细胞；水凝胶在凝结成胶之前，由第一组分和第二组分均匀混合形成水凝胶预聚液；第一组分为I型胶原，第二组分包括甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰化透明质酸；I型胶原质量为水凝胶预聚液的0.1％～0.3％，甲基丙烯酰化明胶质量为水凝胶预聚液的1％～5％，甲基丙烯酰化透明质酸质量为水凝胶预聚液的0.01％～0.2％。本发明专利技术形成了与正常人体真皮层硬度相似的真皮层，能够有效阻止皮肤细胞生长导致的收缩，满足全层皮肤模型的长时间培养。模型的长时间培养。模型的长时间培养。

【技术实现步骤摘要】
皮肤模型及其制备方法、对化合物检测的方法


[0001]本专利技术属于体外三维组织培养
，具体涉及一种皮肤模型及其制备方法、以及一种利用皮肤模型对化合物检测的方法。

技术介绍

[0002]与表皮皮肤模型相比，全层皮肤模型具有完整的表皮层和真皮层结构，其分化程度和蛋白表达方面更加接近真实的人体皮肤。在正常人体皮肤组织中，真皮层位于表皮层下方，由细胞、纤维和基质成分组成。真皮层中的细胞主要为成纤维细胞，真皮成纤维细胞能够合成胶原、纤维粘连蛋白、板层素、糖胺聚糖等细胞外基质成分，同时成纤维细胞也能产生一类降解这些细胞外基质的酶，称为基质金属蛋白酶，该基质金属蛋白酶几乎能降解细胞外基质中的各种蛋白成分，以使得真皮层存在降解的问题。
[0003]目前，大多使用胶原材料与成纤维细胞共混的方式构建真皮层，这种方式虽然可以实现角质细胞的粘附与生长，但是，由于胶原材料的机械强度仅在200Pa左右，存在机械强度低且分布不均匀的情况，使得真皮层发生组织收缩，同时，在成纤维细胞的影响下，真皮层还存在降解等问题，进而导致全层皮肤模型不能长时间培养，限制了其在烧伤整形与药物开发等行业的应用。
[0004]针对上述技术问题，本专利技术提出一种皮肤模型及其制备方法、以及一种利用皮肤模型对化合物检测的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种皮肤模型及其制备方法、以及一种利用皮肤模型对化合物检测的方法。
[0006]本专利技术的一方面，提供一种皮肤模型，包括：从上到下依次设置的表皮层与真皮层；其中，
[0007]所述表皮层包括角质细胞；
[0008]所述真皮层包括水凝胶以及均匀掺杂在所述水凝胶中的成纤维细胞；其中，
[0009]所述水凝胶在凝结成胶之前，由第一组分和第二组分均匀混合形成水凝胶预聚液；所述第一组分为I型胶原，所述第二组分包括甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰化透明质酸；其中，所述I型胶原质量为所述水凝胶预聚液的0.1％～0.3％，所述甲基丙烯酰化明胶质量为所述水凝胶预聚液的1％～5％，所述甲基丙烯酰化透明质酸质量为所述水凝胶预聚液的0.01％～0.2％。
[0010]优选地，所述水凝胶的机械强度波动范围小于0.5KPa。
[0011]优选地，所述水凝胶的机械强度范围为0.1KPa～10KPa。
[0012]优选地，所述水凝胶还包括甲基丙烯酰化丝素蛋白、聚乙二醇、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯和聚乙二醇二丙烯酸酯中的一种或多种。
[0013]本专利技术的另一方面，提供一种制备前文记载的所述皮肤模型的方法，具体包括：
[0014]获取水凝胶预聚液；所述水凝胶预聚液由第一组分和第二组分均匀混合形成，所述第一组分为I型胶原，所述第二组分包括甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰化透明质酸；其中，所述I型胶原质量为所述水凝胶预聚液的0.1％～0.3％，所述甲基丙烯酰化明胶质量为所述水凝胶预聚液的1％～5％，所述甲基丙烯酰化透明质酸质量为所述水凝胶预聚液的0.01％～0.2％；
[0015]在所述水凝胶预聚液中加入成纤维细胞悬液，以得到混合溶液；
[0016]对所述混合溶液经光照射和/或热处理，以进行聚合培养，得到真皮层；
[0017]在所述真皮层上方接种角质细胞，经培养后形成表皮层。
[0018]优选地，所述获取水凝胶预聚液，包括：
[0019]将所述第一组分溶于酸性溶液，形成第一溶液；
[0020]将所述第二组分溶于缓冲溶液并加入光引发剂，形成第二溶液；
[0021]将所述第一溶液与所述第二溶液均匀混合，调节pH至7～7.8，得到水凝胶预聚液。
[0022]优选地，所述将所述第一组分溶于酸性溶液，形成第一溶液，包括：
[0023]获取6M的乙酸；
[0024]将所述I型胶原添加至所述乙酸中，在4℃～8℃下溶解成胶原母液；
[0025]调整所述胶原母液的pH值至小于7，得到所述第一溶液。
[0026]优选地，所述对所述混合溶液经光照射和/或热处理，以进行聚合培养，得到真皮层，包括：
[0027]将所述混合溶液置于气液培养小室中，经光照射和/或热处理以形成包含成纤维细胞的水凝胶；其中，所述光照射为使用波长范围为320nm～480nm，光强范围为5mw/cm2～100mw/cm2的条件下光照射30s～300s；所述热处理为在35℃～40℃的条件下热处理20min～40min；
[0028]在所述气液小室内外添加成纤维细胞培养基，以对所述包含成纤维细胞的水凝胶在35℃～40℃、5％CO2的条件下培养4d～9d，得到真皮层。
[0029]优选地，所述在所述真皮层上方接种角质细胞，经培养后形成表皮层，包括：
[0030]在所述真皮层上方接种角质细胞；
[0031]在所述气液培养小室外添加与所述角质细胞相应的无血清培养基，接种后的预设时间段吸弃所述气液培养小室内的成纤维细胞培养基，将所述无血清培养基更换为气液培养基，在35℃～40℃、5％CO2的条件下气液培养14d～28d，以形成表皮层。
[0032]本专利技术的另一方面，提供一种利用前文记载的所述皮肤模型对化合物检测的方法，包括以下步骤：
[0033]向所述皮肤模型引入待测化合物；
[0034]获取所述待测化合物对所述皮肤模型的作用结果。
[0035]本专利技术通过调节I型胶原、甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰化透明质酸的浓度，可以保证三者的溶液分别在对应的环境中较慢成胶，并且低温混合时也将较慢成胶，从而可以防止在未与细胞混合前水凝胶预聚液中胶核的形成，由此可以提高水凝胶预聚液与细胞混合的均匀程度，提高后续水凝胶的机械性能，从而使水凝胶材料达到良好的抗收缩性。基于该硬度可调、机械强度高的水凝胶材料与成纤维细胞混合，形成了一种与正常人体真皮硬度相似且机械强度均匀的真皮层，可以抑制真皮层中的组织发生收缩与降解，稳定性较
好，可以满足全层皮肤模型的长时间培养。
附图说明
[0036]图1为本专利技术皮肤模型制备方法的流程框图；
[0037]图2为本专利技术真皮层培养第7天成纤维细胞形态；
[0038]图3为正常人体皮肤和胶原与本专利技术实施例1、2、3的不同材料的弹性模量；
[0039]图4为本专利技术实施例2的真皮层材料SEM扫描图；
[0040]图5为纯胶原材料与本专利技术实施例2真皮层水凝胶材料构建的全层模型第14天(角质层构建第10天)收缩情况对比图；其中，5A为纯胶原材料，5B为实施例2；
[0041]图6为本专利技术实施例2的全层皮肤模型石蜡切片苏木精伊红染色；
[0042]图7为本专利技术实施例2的兜甲蛋白(Loricrin)、角蛋白14
[0043](CK14)、层粘连蛋白5(Laminin5)和波形蛋白(Vimentin)免疫荧光染色图。
具体实施方式
[0044]为使本领域技术人员更好地理本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种皮肤模型，其特征在于，包括：从上到下依次设置的表皮层与真皮层；其中，所述表皮层包括角质细胞；所述真皮层包括水凝胶以及均匀掺杂在所述水凝胶中的成纤维细胞；其中，所述水凝胶在凝结成胶之前，由第一组分和第二组分均匀混合形成水凝胶预聚液；所述第一组分为I型胶原，所述第二组分包括甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰化透明质酸；其中，所述I型胶原质量为所述水凝胶预聚液的0.1％～0.3％，所述甲基丙烯酰化明胶质量为所述水凝胶预聚液的1％～5％，所述甲基丙烯酰化透明质酸质量为所述水凝胶预聚液的0.01％～0.2％。2.根据权利要求1所述的皮肤模型，其特征在于，所述水凝胶的机械强度波动范围小于0.5KPa。3.根据权利要求1所述的皮肤模型，其特征在于，所述水凝胶的机械强度范围为0.1KPa～10KPa。4.根据权利要求1所述的皮肤模型，其特征在于，所述水凝胶还包括甲基丙烯酰化丝素蛋白、聚乙二醇、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯和聚乙二醇二丙烯酸酯中的一种或多种。5.一种制备如权利要求1至4任一项所述的皮肤模型的方法，其特征在于，具体包括：获取水凝胶预聚液；所述水凝胶预聚液由第一组分和第二组分均匀混合形成，所述第一组分为I型胶原，所述第二组分包括甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰化透明质酸；其中，所述I型胶原质量为所述水凝胶预聚液的0.1％～0.3％，所述甲基丙烯酰化明胶质量为所述水凝胶预聚液的1％～5％，所述甲基丙烯酰化透明质酸质量为所述水凝胶预聚液的0.01％～0.2％；在所述水凝胶预聚液中加入成纤维细胞悬液，以得到混合溶液；对所述混合溶液经光照射和/或热处理，以进行聚合培养，得到真皮层；在所述真皮层上方接种角质细胞，经培养后形成表皮层。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述获取水凝胶预聚液...

【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，
申请(专利权)人：江苏艾玮得生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：