一种基于小球藻制备利拉鲁肽原料药的方法及其制备的利拉鲁肽原料药技术

本发明专利技术涉及利拉鲁肽原料药制备领域，特别涉及一种基于小球藻制备利拉鲁肽原料药的方法及其制备的利拉鲁肽原料药，利拉鲁肽原料药的蛋白序列经过密码子偏好修正后不包括起始密码子和终止密码子的序列为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，本发明专利技术公开了一种基于小球藻制备利拉鲁肽原料药的方法，实现了生物质资源的回用，提供了电转操作的具体参数，促进小球藻的生长，并公开了一种蛋白质的纯化处理方法，实现蛋白质的纯化。实现蛋白质的纯化。实现蛋白质的纯化。

【技术实现步骤摘要】
一种基于小球藻制备利拉鲁肽原料药的方法及其制备的利拉鲁肽原料药


[0001]本专利技术涉及利拉鲁肽原料药制备领域，特别涉及一种基于小球藻制备利拉鲁肽原料药的方法及其制备的利拉鲁肽原料药。

技术介绍

[0002]浓醪废水资源化处理是发酵行业产业优化的关键问题之一；微藻对浓醪废水资源转化中的多肽原料药开发潜力巨大；本研究以同步处理浓醪废水和废水生物质资源回用为研究目标，实现转基因工程绿藻制备利拉鲁肽原料药；绿藻表观调控是污水生物质资源化和高附加值产品开发的前沿技术；项目为浓醪废水的高附加值资源化处理提供新思路，是蛋白原料药的规模化低成本制备和浓醪废水的资源化处理的交叉领域，具有良好的应用前景和研发价值；
[0003]2013年，Nature报道了3个实验室利用基因编辑系统对单子叶植物小麦、水稻和对双子叶植物烟草、拟南芥的基因组进行定点编辑的研究并实现对它们的基因组定点编辑的操作，表明了基因编辑技术可编辑植物基因组DNA；但目前为止，尚未见到有关基因编辑在转基因工程绿藻制备外源多肽药蛋白的报道，以及CAS9蛋白是否对绿藻细胞有免疫原性和毒副作用，并进而影响细胞代谢和光合效率的报道，这些问题都是浓醪液(包括糖浆、废醪等)高效处理和生物高附加值产品资源化制备领域迫切需要研究及解决的；因此寻找到合适的表达载体,建立高效的转化方法，利用新型的基因编辑工具对基因进行定点编辑，是基因工程在小球藻研究及应用中急需实现的技术；本研究将得到高效的小球藻基因编辑体系，并培育制备多肽药的转基因藻；该技术是严防出现多肽药技术鸿沟的必要保障；
[0004]长链多肽药物尤其是原料药的制备体系研发对于多肽药领域具有重要意义，对于推动新型国产多肽药占领国际多肽药市场具有决定性作用，是严防出现多肽药技术鸿沟的必要保障；《产业结构调整指导目录》中鼓励类医药模块指出，鼓励具有自主知识产权的新药开发及生产，鼓励大规模药用多肽和核酸合成、纯化技术开发和应用；中国多肽药物发展特别是长链多肽药物研发亟待技术瓶颈的突破；长链多肽原料药的蛋白表达系统的效率和稳定性是技术的核心突破口；作为全球糖尿病的首推药物，仅美国市场利拉鲁肽原料药年需求量就达到约536kg；多肽药物年均复合增长率保持在10％左右，可见其全球市场发展潜力巨大；
[0005]因此，如何有效利用小球藻制备利拉鲁肽原料药，实现生物质资源的回用，成为了待解决的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于，提供一种基于小球藻制备利拉鲁肽原料药的方法及其制备的利拉鲁肽原料药，以解决以上的问题。
[0007]本专利技术的目的是由以下技术方案实现的：
[0008]一种由小球藻制备的利拉鲁肽原料药，所述利拉鲁肽原料药的蛋白序列经过密码子偏好修正后不包括起始密码子和终止密码子的序列为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
[0009]SEQ ID NO.1的核苷酸序列为：
[0010]CAC GCC GAG GGC ACC TTC ACC AGC GAC GTC AGC AGC TAT CTG GAG GGC CAG GCC GCC AAA GAG TTC ATC GCC TGG CTG GTC AGG GGC AGG GGC
[0011]其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.2：
[0012]HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVRGR G。
[0013]一种基于小球藻制备利拉鲁肽原料药的方法，具体包括以下步骤：
[0014]S1：取用带有Hygromycin抗性基因的植物双元表达载体pCAMBIA 1302，确定Hygromycin基因的最终DNA序列；
[0015]S2：取100
‑
200mg的植物双元表达载体的植物组织放入液氮中，在液氮环境中将植物组织碾碎；
[0016]S3：向所述S2中的混合物加入1mL的裂解液，加入10mg/mL的蛋白酶抑制剂和10mg/mL PMSF并于4℃下裂解20min，期间每隔5min震荡1次，处理完毕后在4℃，14000转条件下离心30min；
[0017]S4：吸取所述S2中的上清至新管中，得到植物组织蛋白，并保存于
‑
80℃下，即用即取；
[0018]S5：采用电转化法将所述步骤S4中获得的植物组织蛋白引入小球藻中，并采用所述权利要求1中的mCHERRY荧光蛋白建立小球藻中引入的蛋白表达筛选，电转操作的具体参数为电压230V、电容50uF、电阻200ohms；电压400V、电容25uF、电阻200ohms；电压800V、电容10uF、电阻400ohms；
[0019]mCHERRY荧光蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.3：
[0020][0021][0022]用于建立绿藻蛋白表达筛选的标签蛋白mCHERRY荧光蛋白序列来源于质粒载体(cloning vector N
‑
term 8xHis mcherry pCellFree_G05)的全序列，mCHERRY荧光蛋白对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.4：
[0023]KGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK；
[0024]S6：将小球藻中的蛋白质做纯化处理；
[0025]S7：将小球藻置于存在N、P元素的环境中，对小球藻进行培养，得到如权利要求1所述的利拉鲁肽原料药。
[0026]优选地，所述利拉鲁肽原料药的化学名称为：Arg34Lys26
‑
(N
‑
ε
‑
(γ
‑
Glu(N
‑
α
‑
十六酰基)))
‑
GLP
‑
1。
[0027]优选地，所述步骤S6具体为：
[0028]将所述步骤S5的小球藻置于HEPES缓冲液中，在4℃和12000r/min下超声热解后，离心30s后清洗三分钟，直到绝大多数细菌沉淀，并采用0.22μm孔径过滤。
[0029]优选地，所述HEPES缓冲液包括：20mmol的NaCl和200mmol的HEPES，其pH值为7.5。
[0030]本专利技术的有益效果为：
[0031]1、本专利技术公开了一种基于小球藻制备利拉鲁肽原料药的方法，实现了生物质资源的回用；
[0032]2、本专利技术提供了电转操作的具体参数，促进小球藻的生长；
[0033]3、本专利技术公开了一种蛋白质的纯化处本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种由小球藻制备的利拉鲁肽原料药，其特征在于：所述利拉鲁肽原料药的蛋白序列经过密码子偏好修正后不包括起始密码子和终止密码子的序列为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。2.一种基于小球藻制备利拉鲁肽原料药的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：S1：取用带有Hygromycin抗性基因的植物双元表达载体pCAMBIA 1302，确定Hygromycin基因的最终DNA序列；S2：取100
‑
200mg的植物双元表达载体的植物组织放入液氮中，在液氮环境中将植物组织碾碎；S3：向所述S2中的混合物加入1mL的裂解液，加入10mg/mL的蛋白酶抑制剂和10mg/mL PMSF并于4℃下裂解20min，期间每隔5min震荡1次，处理完毕后在4℃，14000转条件下离心30min；S4：吸取所述S2中的上清至新管中，得到植物组织蛋白，并保存于
‑
80℃下，即用即取；S5：采用电转化法将所述步骤S4中获得的植物组织蛋白引入小球藻中，并采用mCHERRY荧光蛋白建立小球藻中引入的蛋白表达筛选，电转操作的具体参数为电压230V、电容50uF、电阻200ohms；电压400V、电容25uF、...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐亮，孙彩云，孙大志，安孟缘，徐春雷，夏宇，
申请(专利权)人：吉林化工学院，
类型：发明
国别省市：