本发明专利技术提供了基于基因编辑的病毒抵抗猪的构建方法，本发明专利技术属于基因编辑技术领域。包括如下步骤：(1)合成编码Oct4、Sox2、Klf4、Glis1和Lin28中的一种或几种的化学修饰mRNA；(2)构建并合成包含gRNA和CRISPR序列的转座子载体；(3)将所述mRNA和包含gRNA的完整转座子载体转化猪原代皮肤成纤维细胞，获得单克隆目标细胞；(4)将所述单克隆目标细胞的细胞核插入去核卵母细胞中，得到重组细胞；(5)所述重组细胞移植到受体的输卵管中，培养得到病毒抵抗猪。本发明专利技术基于细胞重编程蛋白因子，延长有效基因编辑窗口，实现基因组多位点基因编辑，构建了一种病毒抵抗猪。建了一种病毒抵抗猪。建了一种病毒抵抗猪。
【技术实现步骤摘要】
一种基于基因编辑的病毒抵抗猪的构建方法
[0001]本专利技术涉及基因编辑
，尤其涉及基于基因编辑的病毒抵抗猪的构建方法。
技术介绍
[0002]猪内源性病毒(PERV)为逆转录病毒，整合在猪基因组中，并有几十个到上百个病毒拷贝，虽然目前还没有感染人类的报道，但是其在体外可以感染人体细胞，在异种器官移植和免疫抑制剂的作用下可能会感染处于免疫抑制的器官受体，从异种移植安全性来说，完全去除猪内源性病毒十分必要。
[0003]目前有使用CRISPR系统对猪内源性病毒关键共性序列进行“瞬时”敲除和破坏而制备所谓“无猪内源性病毒基因编辑猪”，但是这个猪存在的重大技术漏洞就是：猪内源性病毒有其固有的宿主，所以这个“无猪内源性病毒基因编辑猪”会被猪内源性病毒再次感染，所以目前的“无猪内源性病毒基因编辑猪”仅仅是现有条件无法检测出猪内源性病毒活性而已。
[0004]与此同时，猪内源性病毒序列在猪基因组中有几十到上百个拷贝，上述报道的“无猪内源性病毒基因编辑猪”实际在基因组超过40位点进行基因编辑(敲除和破坏)，这样会诱导和加速猪体细胞的衰老而导致完全猪内源性病毒有效序列敲除及破坏和克隆猪制备的比例特别低。
[0005]有鉴于此，需要提供一种猪内源性病毒抵抗基因编辑猪的构建方法，甚至是针对多种病毒都有效的病毒抵抗基因编辑猪的构建方法。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种基于细胞重编程蛋白因子，通过维持和/或逆转猪体细胞衰老，从而延长猪体细胞有效基因编辑窗口，来实现猪体细胞基因组多位点基因编辑，从而构建了一种病毒抵抗猪。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]本专利技术提供了一种基于基因编辑的病毒抵抗猪的构建方法，包括如下步骤：
[0009](1)合成编码Oct4、Sox2、Klf4、Glis1和Lin28中的一种或几种的化学修饰mRNA；
[0010](2)构建并合成包含gRNA和CRISPR序列的转座子载体；
[0011](3)将所述mRNA和包含gRNA的完整转座子载体转化猪原代皮肤成纤维细胞，获得单克隆目标细胞；
[0012](4)将所述单克隆目标细胞的细胞核插入去核卵母细胞中，得到重组细胞；
[0013](5)所述重组细胞移植到受体的输卵管中，培养得到病毒抵抗猪。
[0014]优选的，所述Oct4的mRNA序列如SEQ ID NO：1所示；所述Sox2的mRNA序列如SEQ ID NO：2所示；所述Klf4的mRNA序列如SEQ ID NO：3所示；所述Glis1的mRNA序列如SEQ ID NO：4所示；所述Lin28的mRNA序列如SEQ ID NO：5所示。
[0015]优选的，所述转座子载体中包含嘌呤霉素抵抗基因和多西环素开关。
[0016]优选的，所述包含gRNA的完整转座子载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
[0017]优选的，所述gRNA的序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。
[0018]优选的，所述病毒抵抗猪为抵抗猪内源性病毒、非洲猪瘟病毒或蓝耳病病毒的猪。
[0019]优选的，所述病毒抵抗猪为抵抗猪内源性病毒猪时，所述gRNA靶向猪内源性病毒序列的Pol序列。
[0020]本专利技术还提供了一种所述的构建方法得到的病毒抵抗猪作为器官移植材料的应用。
[0021]本专利技术提供了一种猪内源性病毒为逆转录病毒抵抗基因编辑猪的构建方法，该方法通过基于化学修饰mRNA编码和瞬时表达细胞重编程蛋白因子(Oct4、Sox2、Klf4、Glis1和Lin28中的一种或几种)，来维持和/或逆转猪体细胞衰老，从而延长猪体细胞有效基因编辑窗口，来实现猪体细胞对其基因组多位点基因编辑的耐受力。同时将完整的CRISPR系统序列含有针对猪内源性病毒有效序列的引导RNA(2个)和CRISPR蛋白，实现超过40个猪内源性病毒拷贝的彻底基因敲除和破坏的同时，因为该完整的CRISPR系统可以存在于猪的基因组中，可以持续地对猪内源性病毒进行破坏，从而实现对猪内源性病毒进行抵抗，同现有报道的“无猪内源性病毒基因编辑猪”相比高度有利。同时本专利技术的提供的方法还可以用于其他病毒的预防和抵抗，例如非洲猪瘟病毒，蓝耳病病毒。
附图说明
[0022]图1为实施例2构建的转座子载体图；
[0023]图2为实施例5中猪内源性病毒活性序列被CRISPR敲除的鉴定结果；
[0024]图3为实施例5中猪内源性病毒抵抗猪体细胞抵抗猪内源性病毒的鉴定结果。
具体实施方式
[0025]下面结合实施例对本专利技术提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。
[0026]实施例1
[0027]步骤一、特异的DNA模版的合成：5个重编程蛋白因子Oct4、Sox2、Klf4、Glis1、Lin28。
[0028]1、编码重编程蛋白因子的双链DNA
[0029]A：编码Oct4蛋白因子的双链DNA：gblock，直接订购于美国IDT公司，该DNA序列信息如下(1)+(2)+(3)+(4)：
[0030](1)T7启动子：TAATACGACTCACTATAGGG。
[0031](2)5
’
非翻译区序列：
[0032]AAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC。
[0033](3)Oct4开放阅读框序列：
[0034]ATGGCGGGACACCTGGCTTCGGATTTCGCCTTCTCGCCCCCTCCAGGTGGTGGAGGTGATGGGCCAGGGGGGCCGGAGCCGGGCTGGGTTGATCCTCGGACCTGGCTAAGCTTCCAAGGCCCTCCTGGAGGGCCAGGAATCGGGCCGGGGGTTGGGCCAGGCTCTGAGGTGTGGGGGATTCCCCCATGCCCCCCGCCGTATGAGTTCTGTGGGGGGATGGCGT
ACTGTGGGCCCCAGGTTGGAGTGGGGCTAGTGCCCCAAGGCGGCTTGGAGACCTCTCAGCCTGAGGGTGAAGCAGGAGTCGGGGTGGAGAGCAACTCCGATGGGGCCTCCCCGGAGCCCTGCACCGTCACCCCTGGTGCCGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTGGAGCAAAACCCGGAGGAGTCCCAGGACATCAAAGCTCTGCAGAAAGAACTCGAGCAATTTGCCAAGCTCCTGAAGCAGAAGAGGATCACCCTGGGATATACACAGGCCGATGTGGGGCTCACCCTGGGGGTTCTATTTGGGAAGGTATTCAGCCAAACGACCATCTGCCGCTTTGAGGCTCTGCAGCTTAG本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于基因编辑的病毒抵抗猪的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)合成编码Oct4、Sox2、Klf4、Glis1和Lin28中的一种或几种的化学修饰mRNA；(2)构建并合成包含gRNA和CRISPR序列的转座子载体；(3)将所述mRNA和包含gRNA的完整转座子载体转化猪原代皮肤成纤维细胞，获得单克隆目标细胞；(4)将所述单克隆目标细胞的细胞核插入去核卵母细胞中，得到重组细胞；(5)所述重组细胞移植到受体的输卵管中，培养得到病毒抵抗猪。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述Oct4的mRNA序列如SEQ ID NO：1所示；所述Sox2的mRNA序列如SEQ ID NO：2所示；所述Klf4的mRNA序列如SEQ ID NO：3所示；所述Glis1的mRNA序列如SEQ ID N...
【专利技术属性】
技术研发人员：王刚，于寅，盛强龙，杨帆，
申请(专利权)人：臻赫医药杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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