一种有效纯化病毒样颗粒的方法技术

本发明专利技术提供了一种有效纯化病毒样颗粒的方法。本发明专利技术所提供的方法重点包括两步，其中一步是采用内部孔径比所需纯化的病毒样颗粒直径小的小孔阴离子层析介质进行层析，另一步是采用内部孔径为所需纯化的病毒样颗粒直径2

【技术实现步骤摘要】
一种有效纯化病毒样颗粒的方法


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体地说是一种有效纯化病毒样颗粒的方法。

技术介绍

[0002]在生物医药领域，细胞培养或酵母表达重组病毒样颗粒，通常是由单体或多聚体蛋白自发组装形成的类病毒颗粒。与目的蛋白病毒样颗粒有着接近电荷的VP1单体、VP1单体截短蛋白、宿主蛋白、酶及核酸等，这些杂质通过传统的吸附洗脱模式可以有效去除。但是当强吸附杂质的含量较多时，会明显降低目的蛋白病毒样颗粒的载量，使目的蛋白收集主峰中，往往掺杂着与病毒样颗粒目的蛋白电荷性质接近的多种杂质，最终仍有一些杂质需要更多步层析才可以完全去除。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种有效纯化病毒样颗粒的方法，以去除预处理样品中的大部分与目的蛋白性质接近的杂质，增加后续层析的载量。
[0004]本专利技术是这样实现的：一种有效纯化病毒样颗粒的方法，包括如下步骤：
[0005]a、将菌体或细胞破碎，通过过滤、离心、沉淀复溶对样品进行粗纯预处理；
[0006]b、将粗纯预处理后的样品负染色，使用透射电镜检测，查找并检测所需纯化的病毒样颗粒的直径；
[0007]c、将缓冲液及上样液pH调节至高于病毒样颗粒等电点1
‑
2.5个pH；
[0008]d、采用内部孔径比所需纯化的病毒样颗粒直径小的小孔阴离子层析介质进行层析；
[0009]e、采用内部孔径为所需纯化的病毒样颗粒直径2
‑
8倍的大孔阴离子层析介质进行层析；
[0010]f、通过分子筛层析去除大颗粒聚体；
[0011]g、通过透析或超滤换盐，将目的蛋白的缓冲液置换到适合长期储存的稳定体系。
[0012]优选的，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris
‑
HCl缓冲液、醋酸
‑
醋酸盐缓冲液或柠檬酸
‑
柠檬酸盐缓冲液。
[0013]优选的，所述小孔阴离子层析介质其基体可以是Sepharose HP(平均孔径35.5nm)，Bestarose HP(平均孔径33nm)，Sephacryl S
‑
400HR(平均孔径31nm)，Source 30(平均孔径30nm)，Sepharose 6FF(平均孔径29nm)，Sepharose FF(平均孔径26nm)，Bestarose FF(平均孔径25.8nm)，Sepharose XL(平均孔径17nm)或Sephacryl S
‑
300HR(平均孔径13nm)等对生物蛋白作用温和的小孔基体，所用配基为二乙氨乙基、季铵乙基或季氨基配基系列中的任意一种。
[0014]更优选的，所述小孔阴离子层析介质其基体是Source 30或Sepharose XL；所用配基为季氨基(Q)。
[0015]优选的，所述大孔阴离子层析介质其基体为DEAE
‑
AP
‑
280(平均孔径280nm)、Nuvia
(平均孔径150nm)、Nuvia HP(平均孔径200nm)、DEAE
‑
AP
‑
120(平均孔径120nm)或POROS(平均孔径100nm)等对生物蛋白作用温和的大孔基体，所用配基为二乙氨乙基、季铵乙基或季氨基配基系列中的任意一种。
[0016]更优选的，所述大孔阴离子层析介质其基体为DEAE
‑
AP
‑
120、DEAE
‑
AP
‑
280或POROS，所用配基为季氨基(Q)。
[0017]本专利技术的有益效果：
[0018]1)本专利技术方法具有成本低、杂质载量高、样品处理量大的特点。
[0019]2)本专利技术可以有效去除常规吸附洗脱层析中难以去除干净的与目的蛋白等电点接近、携带电荷量相近的小分子宿主蛋白、酶、核酸、VP1单体、VP1截短蛋白，减少最终产品中杂质的含量。
[0020]3)这种新型方法可以大载量去除带负电量强于目的蛋白病毒样颗粒的大部分杂质，明显提高后续层析对目的蛋白病毒样颗粒的载量。
[0021]本专利技术为需要纯化病毒样颗粒疫苗的科研、制药、生物制品企业，在设计纯化工艺时，提供一种载量高、成本低、可以有效去除与目的蛋白电荷接近的核酸、宿主蛋白、VP1单体、VP1截短蛋白等杂质的有效方法。
附图说明
[0022]图1是本专利技术实施例1中样品经粗纯预处理后的透射电镜图。
[0023]图2是本专利技术实施例1中小孔阴离子层析的结果示意图。
[0024]图3是本专利技术实施例1中大孔阴离子层析的结果示意图。
[0025]图4是本专利技术实施例1中分子筛层析的结果示意图。
[0026]图5是本专利技术对比例1中大孔阴离子层析的结果示意图。
[0027]图6是本专利技术对比例1中分子筛层析的结果示意图。
[0028]图7是本专利技术实施例2中样品经粗纯预处理后的透射电镜图。
[0029]图8是本专利技术实施例2中小孔阴离子层析的结果示意图。
[0030]图9是本专利技术实施例2中大孔阴离子层析的结果示意图。
[0031]图10是本专利技术实施例2中分子筛层析的结果示意图。
[0032]图11是本专利技术实施例3中样品经粗纯预处理后的透射电镜图。
[0033]图12是本专利技术实施例3中小孔阴离子层析的结果示意图。
[0034]图13是本专利技术实施例3中大孔阴离子层析的结果示意图。
[0035]图14是本专利技术实施例3中分子筛层析的结果示意图。
具体实施方式
[0036]本专利技术的方法具体包括如下步骤：
[0037]1)将菌体或细胞破碎，通过过滤、离心、沉淀复溶对样品进行粗纯预处理。
[0038]2)将粗纯预处理后的样品负染色，使用透射电镜检测，查找并检测所需纯化的病毒样颗粒的直径。具体是：通过透射电镜软件，计算完整病毒样颗粒的平均直径。
[0039]本专利技术所提供的方法重点分两步，其中一步是采用内部孔径比所需纯化的病毒样颗粒直径小的小孔阴离子层析介质进行层析(下面实施例中将该过程简称为小孔阴离子层
析)，另一步是采用内部孔径为病毒样颗粒直径2
‑
8倍的大孔阴离子层析介质进行层析(下面实施例中将该过程简称为大孔阴离子层析)。下面进行详细介绍。
[0040]3)选择内部孔径比所需纯化的病毒样颗粒直径小的强阴离子层析介质，根据粗纯预处理后样品的体积和浓度，装填相应体积的层析柱，装填柱体积为样品量的1/50—1/5，作为新型层析方法的小孔阴离子层析柱备用。同样，装填大孔阴离子层析柱备用。
[0041]4)将缓冲液及上样液pH调节至高于病毒样颗粒等电点1
‑
2.5个pH。所用的缓冲液可以为磷酸盐缓冲液体系、Tris
‑
HCl缓冲液、醋酸
‑
醋酸盐缓冲液体系或柠檬酸...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种有效纯化病毒样颗粒的方法，其特征是，包括如下步骤：a、对样品进行粗纯预处理；b、将粗纯预处理后的样品负染色，使用透射电镜检测，查找并检测所需纯化的病毒样颗粒的直径；c、将缓冲液及上样液pH调节至高于病毒样颗粒等电点1
‑
2.5个pH；d、采用内部孔径比所需纯化的病毒样颗粒直径小的小孔阴离子层析介质进行层析；e、采用内部孔径为所需纯化的病毒样颗粒直径2
‑
8倍的大孔阴离子层析介质进行层析；f、对步骤e中收集的层析液进行分子筛层析；g、对分子筛层析后收集的层析液进行透析或超滤换盐，将目的蛋白的缓冲液置换到适合储存的稳定体系。2.根据权利要求1所述的有效纯化病毒样颗粒的方法，其特征是，步骤a中，对样品进行粗纯预处理，具体是：将样品破碎，之后过滤、离心、沉淀复溶。3.根据权利要求2所述的有效纯化病毒样颗粒的方法，其特征是，步骤c中所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris
‑
HCl缓冲液、醋酸
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醋酸盐缓冲液或柠檬酸
‑
柠檬酸盐缓冲液。4.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张卫婷，李岩异，刘容麟，庞晓敏，陈金利，张红霞，马东杰，李晓，董乾，
申请(专利权)人：华北制药金坦生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：