荧光标志物的检测方法及检测设备技术

本发明专利技术提供了一种荧光标志物的检测方法及检测设备，所述检测方法包括基于荧光材料组合中各种荧光材料发射光谱峰的位置差异和/或斯托克斯位移的差异进行编码。该检测方法可以打破荧光编码受制于发射光谱重叠的限制，利用发射光谱以及斯托克斯位移共编码技术，实现多重免疫组织化学/免疫荧光的超多元编码，同时该检测方法不依赖迭代顺序抗体标记和成像技术、不需要多光谱成像技术就可以实现多重免疫组织化学/免疫荧光的超多元检测，适用于常规的成像仪器、成本低、扫描速度快。扫描速度快。扫描速度快。

【技术实现步骤摘要】
荧光标志物的检测方法及检测设备


[0001]本专利技术涉及荧光检测
，特别是涉及一种荧光标志物的检测方法及检测设备。

技术介绍

[0002]常规免疫组织化学/免疫荧光(IHC/IF)通常用作组织病理学领域的诊断技术，但存在一定的局限性。其中最主要的局限性是这种技术每次只能检测组织样本上的一个标记物。这可能导致患者样本中重要的预后和诊断信息的错失。以肿瘤浸润性CD8+T细胞为例，可以通过识别CD8、CD3、FOXP3和CD20等抗原的表达来识别CD8+T细胞，单独识别其中的一种抗原可能会导致假阳性或者假阴性的问题。同样的，单一抗原的识别也会导致基于IHC/IF生物标记评估的另一个缺点——高观察者间变异性，不同人对于同一张切片由于缺乏多种判断依据的相互佐证而导致主观的、不可重复的评估结果。
[0003]为了解决上述问题，近年来研究者开发出了多重免疫组织化学/免疫荧光(mIHC/IF)技术，该技术允许在单个组织切片上同时检测多个标记物，并已开始在研究和临床环境中引入使用。通过mIHC/IF技术可以提供有关癌症微环境、预后、治疗和复发的关键信息；可以使用多重检测的方法同时检查肿瘤微环境的不同组成部分，从而深入了解肿瘤
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宿主界面上存在的生物串扰，并提供从亚细胞水平到细胞群水平的信息；可以同时评估多个生物标志物的表达和定位以及它们在细胞之间的共表达或相互作用情况。
[0004]为了实现多重免疫组织化学/免疫荧光(mIHC/IF)，目前主要有以下实现途径：基于非荧光的多重成像技术以及基于荧光的多重成像技术。
[0005]其中基于非荧光的多重成像技术包括多重免疫组织化学连续染色技术、质谱成像技术等。多重免疫组织化学连续染色技术本质是传统免疫组织化学的多次重复实验(可以理解为一次制片、成像就是形成了针对一个标志物的一个图层，通过多个图层的叠加成一张图片，图片中含有反复叠加的多种标志物，从而实现多元检测)。由于需要多次图片叠加，过程复杂；需要反复洗脱底物、抗体剥离、孵育、拍片、制样，时间长。基于质谱的成像技术是通过质谱法对固定细胞或组织的元素或分子成分进行可视化呈现的技术，通过区分不同标志物的分子量或者不同标签的分子量，从而实现多元检测。但是基于质谱的成像技术相对不成熟、成本高昂且扫片速度慢，限制了其发展。
[0006]基于荧光的多重成像技术包括传统的基于不同荧光发射光谱峰的位置的多重免疫荧光成像技术、基于光谱拆分和分析的多光谱成像技术以及迭代顺序抗体标记和成像技术(MxIF和CycIF)等。其中基于不同荧光发射光谱峰的位置的多重免疫荧光成像技术成像速度快，技术成熟、应用的最多，但是由于荧光发射光谱的光谱重叠的限制，目前用于多重免疫荧光的成像系统一般最多可以实现4
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6个荧光标记的标志物的同时检测，这无法满足对与肿瘤组织、癌旁组织、肿瘤微环境的多标志物联合检测的需求。基于光谱拆分和分析的多光谱成像技术(比如Akoya Biosciences公司开发出的自动定量病理成像系统)通过识别、拆分重叠的荧光信号，能够识别和量化多个重叠的生物标志物(最多8个)，而不
会因为信号彼此不混合而受到自发荧光的干扰。但是由于多光谱成像技术扫描、解析速度慢，因此相比于常规的成像技术，多光谱成像技术的成像速度非常慢，通量难以提升；此外，多光谱成像技术的成本高昂，需要特别的仪器才能进行成像分析，而多光谱成像技术掌握在Akoya、PerkinElmer等公司的手中，这就导致这种技术的普适性不高。迭代顺序抗体标记和成像技术通过反复染色—成像—猝灭(抗原修复)的循环实现多元检测，这种方式理论上可以突破荧光发射光谱重叠的限制进行更多元的检测，但是这种方式非常耗时；且抗原与抗体的反应性可能会由于反复的抗原修复而降低，从而导致检测结果出现偏差；同时，多次成像之间需要图像重叠，重叠过程中容易发生位移，导致成像效果不好。因此，亟待开发出一种新的低成本、适用于现有仪器、操作方便的超多元多重编码技术。

技术实现思路

[0007]为解决现有技术的不足，本专利技术提出一种荧光标志物的检测方法及检测设备。区别于传统的mIHC/IF技术基于荧光的发射光谱峰的位置差异进行编码，本专利技术同时利用荧光材料的发射光谱峰的位置差异以及斯托克斯位移的差异进行共编码，不依赖迭代顺序抗体标记和成像技术就可以实现多重免疫组织化学/免疫荧光的超多元检测，适用于常规的成像仪器、成本低、扫描速度快。
[0008]为实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案包括：
[0009]本专利技术第一方面公开了一种荧光标志物的检测方法，所述检测方法包括基于荧光材料组合中各种荧光材料发射光谱峰的位置差异和/或斯托克斯位移的差异进行编码。
[0010]进一步地，所述检测方法包括基于荧光材料组合中各种荧光材料发射光谱峰的位置差异和斯托克斯位移的差异进行共编码。
[0011]进一步地，所述荧光材料组合包括无机荧光材料之间的组合、有机荧光材料之间的组合或所述无机荧光材料及所述有机荧光材料之间的组合。
[0012]进一步地，所述荧光材料组合中，至少有一种荧光材料的斯托克斯位移与其余各种荧光材料的斯托克斯位移差值为50nm以上；和/或至少有一种荧光材料为反斯托克斯位移，区别于其余各种荧光材料的斯托克斯位移。
[0013]进一步地，所述无机荧光材料至少包括量子点、上转换纳米粒子中一种或几种。
[0014]进一步地，所述量子点包括硅量子点、锗量子点、硫化镉量子点、硒化镉量子点、碲化镉量子点、硒化锌量子点、硫化铅量子点、硒化铅量子点、磷化铟量子点、砷化铟量子点、碳量子点中的一种或几种。所述量子点优选为系列纳米晶体。
[0015]进一步地，所述上转换纳米粒子优选为由无机纳米晶摻杂稀土离子构成的材料。优选的，所述上转换纳米粒子为无机纳米晶摻杂钇离子构成的材料。更优选的，所述上转换纳米粒子为含有NaYF4的材料。
[0016]进一步地，所述有机荧光材料至少包括有机荧光染料、有机小分子发光材料、有机高分子发光材料、荧光蛋白中的一种或几种。
[0017]进一步地，所述有机荧光染料包括系列荧光染料、Alexa系列荧光染料、eVolve
TM
系列荧光染料、Opal系列荧光染料、异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明系列荧光染料、花青类荧光染料、德克萨斯红、4',6
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二脒基
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苯基吲哚(DAPI)、碘化丙啶(PI)、Hoechst 33342中的一种或几种。
[0018]进一步地，所述有机小分子发光材料包括恶二唑及其衍生物类、三唑及其衍生物类、香豆素类衍生物、1,8
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萘酰亚胺类衍生物、吡唑啉衍生物、三苯胺类衍生物、卟啉类化合物、咔唑类衍生物、吡嗪类衍生物、噻唑类衍生物、苝类衍生物中的一种或几种。
[0019]进一步地，所述有机高分子发光材料包括共轭聚合物结构的发光材料或侧链聚合物发光材料，优选为聚苯、聚噻吩、聚芴、聚三苯基胺及其衍生物中的一种或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种荧光标志物的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括基于荧光材料组合中各种荧光材料发射光谱峰的位置差异和/或斯托克斯位移的差异进行编码。2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括基于荧光材料组合中各种荧光材料发射光谱峰的位置差异和斯托克斯位移的差异进行共编码。3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述荧光材料组合包括无机荧光材料之间的组合、有机荧光材料之间的组合或所述无机荧光材料及所述有机荧光材料之间的组合。4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述荧光材料组合中，至少有一种荧光材料的斯托克斯位移与其余各种荧光材料的斯托克斯位移差值为50nm以上；和/或至少有一种荧光材料为反斯托克斯位移，区别于其余各种荧光材料的斯托克斯位移。5.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述无机荧光材料至少包括量子点、上转换纳米粒子中一种或几种。6.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述有机荧光材料至少包括有机荧光染料、有机小分子发光材料、有机高分子发光材料、荧光蛋白中的一种或几种。7.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述荧光材料组合为量子点、有机荧光染料、上转换纳米粒子中任意两种或三种的组合。8.如权利要求2至7任一项所述的检测方法，其特征在于，所述基于荧光材料组合中各个荧光材料发射光谱峰的位置差异进行编码包括对不同荧光材料的不同发射光谱峰的位置进行第一重编码，若每一种可区分的发射光谱峰的位置对应一个特定的目标检测物，则进行第一重编码；若每一种可区分的发射光谱峰的位置对应至少两个特定的目标检测物，则进行第二重编码。9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述基于荧光材料组合中各种荧光材料斯托克斯位移的差异进行编码包括对发射光谱峰的位置相同或相近的荧光材料用不同的斯托克斯位移或不同的反斯托克斯位移或斯托克斯位移与反斯托克斯位移的差异进行第二重编码。10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述对不同荧光材料的不同发射光谱峰的位置进行第一重编码包括以下步骤：步骤S1、将不同的荧光材料和不同的反应物之间建立相对应的关系；步骤S2、将标记有不同荧光材料的反应物与待测样本进行反应；步骤S3、根据荧光材料的种类选择对应的荧光通道，检测设备自动切换与荧光通道相对应的第二滤光片进行滤光；步骤S4、用各种激发光激发不同的荧光材料，其中，发射光谱峰的位置不可区分的荧光材料的发射光通过相同的荧光通道对应的同一第二滤光片；发射光谱峰的位置可区分的荧光材料的发射光通过不同的荧光通道对应的不同第二滤光片；步骤S5、用检测器检测通过不同的第二滤光片滤光后的发射光；步骤S6、根据检测器检测到的经过不...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛滔，张亚楠，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：