一种多肽偶联物、抗体及用途制造技术

本发明专利技术属于生物医学技术领域，涉及一种多肽偶联物、抗体及用途。该多肽偶联物是按照以下步骤制备得到：将酵母葡聚糖的分散液与NaIO3混合孵育，离心，收集沉淀物；向沉淀物中加入卵清白蛋白多肽，孵育，离心，收集沉淀，即得。本发明专利技术以GPs为载体偶联多肽制备多肽偶联物，利用GPs的佐剂活性来免疫动物制备抗体，并且制备的多肽偶联物能够用于抗血清效价的检测；同时该多肽偶联物能够用于制备治疗黑色素瘤的疫苗。瘤的疫苗。瘤的疫苗。

【技术实现步骤摘要】
一种多肽偶联物、抗体及用途


[0001]本专利技术属于生物医学
，涉及一种多肽偶联物、抗体及用途。

技术介绍

[0002]疫苗是迄今为止最有效预防传染病及其传播的重要手段。传统疫苗主要是利用灭活或减毒的病原体制备，因其成分复杂并存在病原体毒性恢复等问题，成为疫苗发展的瓶颈。近年来，随着合成生物学的发展，核酸疫苗、基因工程疫苗和多肽疫苗的研究取得突破性发展，如多肽疫苗是利用化学合成技术和基因工程表达等方法制备的新型疫苗，具有分子量小、纯度高、生物安全性高等特点，但它们与传统疫苗相比，免疫原性较弱、在体内微环境中很容易降解以及难以进入细胞等缺点。因此，如何增强多肽抗原半衰期、抗原摄入方式、免疫应答的类型已成为目前疫苗研究的热点。
[0003]佐剂已是目前疫苗中的关键成分，旨在增强抗原的免疫原性，提高机体对抗原的免疫应答水平，减少抗原的用量和疫苗的接种次数，从而降低疫苗的成本。目前，临床或实验室使用的佐剂主要有铝佐剂和弗氏佐剂。其中铝佐剂能够激活机体的体液免疫，被长期广泛应用于全球儿童计划免疫中，但疫苗中铝佐剂的副作用尤其是神经系统毒副作用反应也逐渐暴露，成为其进一步临床使用的绊脚石。此外，弗氏佐剂使用时需要长时间的乳化，致使操作繁琐，需要专门的设备，并且易引起肉芽肿、接种部位的炎症和损伤。因此，如何调节佐剂在体内的安全性和免疫应答程度，使得机体细胞或体液免疫的强度恰到好处，是佐剂研究亟待解决的问题之一。
[0004]酵母β
‑
glucan微球(GPs)是存在于酵母细胞壁中的一种具有提高免疫力的多糖，占酵母细胞壁干重的29％，主要是由β
‑
1,3
‑
D
‑
葡萄糖构成，具有独特的分子结构，通常以三股螺旋构象形式存在，这种结构也赋予它具有独特的生理功能。GPs作为一种病原相关分子模式(PAMPs)，通过识别表达于DCs、单核细胞/巨噬细胞、中性粒细胞和一些T细胞表面的dectin
‑
1受体，激活Raf
‑
1和Syk激酶信号通路，引起MAPK激酶、NFAT和NF
‑
κB的磷酸化，导致诱导靶细胞反应的发生，最终增加机体固有和获得性免疫反应。但酵母β
‑
glucan微球是否可以作为佐剂使用尚未见报道。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术中弗氏佐剂繁琐的乳化程序以及多肽需要与载体蛋白偶联的缺点，本专利技术以GPs为载体偶联多肽制备多肽偶联物，利用GPs的佐剂活性来免疫动物制备抗体，并且制备的多肽偶联物能够用于抗血清效价的检测。
[0006]为了解决上述问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]本专利技术第一方面，提供一种多肽偶联物，将酵母葡聚糖的分散液与NaIO3混合孵育，离心，收集沉淀物；
[0008]向所述沉淀物中加入卵清白蛋白多肽，孵育，离心，收集沉淀，即得。
[0009]优选地，所述酵母葡聚糖与所述卵清白蛋白多肽的的质量比为5～20∶1。
[0010]优选地，将酵母葡聚糖的分散液与NaIO3溶液混合孵育，且NaIO3溶液的浓度为0.1M，所述酵母葡聚糖与NaIO3溶液的用量比为5mg～10mg∶1mL。
[0011]优选地，所述孵育是在室温下振荡1～2h，所述离心是在2500～4000rpm离心5～8min。
[0012]优选地，所述酵母葡聚糖是按照以下步骤制备得到：
[0013]向酵母中加入氢氧化钠溶液，80～90℃下搅拌1h，离心，收集沉淀；
[0014]将所述沉淀加入1L水溶解后，调pH至4.0～4.5，70～75℃下搅拌1h，离心，所得沉淀用去离子水洗涤，离心，所得沉淀用异丙醇洗涤，离心，所得沉淀用丙酮洗涤，离心，收集沉淀，干燥，得到所述酵母葡聚糖。
[0015]优选地，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.8～1.2moL/L，所述酵母与所述氢氧化钠溶液的用量比为1.0～1.2g∶10mL。
[0016]本专利技术第二方面，提供一种所述多肽偶联物在制备抗肿瘤疫苗中的用途。
[0017]优选地，所述肿瘤为黑色素瘤。
[0018]本专利技术第三方面，提供一种所述多肽偶联物在制备检测抗体效价的试剂或试剂盒中的用途。
[0019]本专利技术第四方面，提供一种抗体，其是利用所述多肽偶联物免疫动物后获得。
[0020]对比现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0021](1)本专利技术将卵清白蛋白多肽与酵母葡聚糖直接偶联，省去了多肽与载体蛋白的偶联，并便于免疫细胞吞噬，提高了多肽的免疫原性。此外，多肽与酵母葡聚糖的偶联产物还可用于检测抗体的效价，并用于制备治疗黑色素瘤的疫苗。
[0022](2)本专利技术以酵母β
‑
glucan微球GPs为载体偶联多肽，利用GPs的佐剂活性来免疫动物制备抗体，省去了弗氏佐剂繁琐的乳化过程，且酵母β
‑
glucan微球为中空结构易负载多肽，能够提供免疫制剂的免疫活性。
[0023](3)本专利技术提供的方法取材容易、操作简单、可以大规模的生产，且成本较低。
附图说明
[0024]图1是葡聚糖微球的外观示意图；
[0025]图2是偶联多肽的葡聚糖微球；
[0026]图3是葡聚糖微球偶联多肽免疫小鼠血清抗体效价的检测；
[0027]图4是各组小鼠体内黑色素瘤体积大小对比图。
具体实施方式
[0028]以下结合实施例对本专利技术做进一步说明，本专利技术包括但不仅限于以下实施例
[0029]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0030]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，所用卵清白蛋白多肽(OVA
323
‑
339
)购自invivogen公司，货号：vac
‑
isq。
[0031]实施例1
[0032]多肽偶联物的制备
[0033](1)酵母葡聚糖微球(GPs)的制备
[0034]该方法是采用文献报道的实验步骤(Yang Zishan,et al,Biomaterials,2017和Yang Zishan,et al,Int J Biol Macro,2020)，具体操作过程如下：
[0035]①
将100g高活性干酵母(安琪)加入1LNaOH(1M/L)中，置于磁力搅拌器上90℃加热搅拌1h。
[0036]②
3000rpm离心5min，弃上清。加入900mL去离子水，并用HCl调节pH至4.5，定容至1L，然后置于磁力搅拌器上70℃加热搅拌1h。
[0037]③
3000rpm离心5min，收集沉淀，去离子水洗涤3次。
[0038]④
3000rpm离心5min，收集沉淀，异丙醇洗涤4次。
[0039]⑤
3000rpm离心5min本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多肽偶联物，其特征在于，其是按照以下步骤制备得到：将酵母葡聚糖的分散液与NaIO3混合孵育，离心，收集沉淀物；向所述沉淀物中加入卵清白蛋白多肽，孵育，离心，收集沉淀，即得。2.根据所述权利要求1所述的多肽偶联物，其特征在于，所述酵母葡聚糖与所述卵清白蛋白多肽的的质量比为5～20∶1。3.根据权利要求1所述的多肽偶联物，其特征在于，将酵母葡聚糖的分散液与NaIO3溶液混合孵育，且NaIO3溶液的浓度为0.1M，所述酵母葡聚糖与NaIO3溶液的用量比为5mg～10mg∶1mL。4.根据权利要求1所述的多肽偶联物，其特征在于，所述孵育是在室温下振荡1～2h，所述离心是在2500～4000rpm离心5～8min。5.根据权利要求1所述的多肽偶联物，其特征在于，所述酵母葡聚糖是按照以下步骤制备得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨子善，骞少举，郭胜，陈志国，解博红，赵铁锁，于莉莉，陈彩丽，宋向凤，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：