人乳头瘤病毒特异性T细胞受体、表达其的细胞和其用途制造技术

本发明专利技术涉及特异性结合人乳头瘤病毒E7的T细胞受体(TCR)、编码所述TCR的核酸及包含其的工程化细胞，以及制备所述工程化细胞的方法。本发明专利技术还涉及包含所述TCR的融合蛋白或缀合物、编辑人细胞基因组的方法以及用于编辑人细胞基因组的组合物。提供了选择性扩增所述工程化细胞的方法，以及所述TCR和所述工程化细胞在预防和/或治疗人乳头瘤病毒感染中的用途。在预防和/或治疗人乳头瘤病毒感染中的用途。

【技术实现步骤摘要】
人乳头瘤病毒特异性T细胞受体、表达其的细胞和其用途


[0001]本专利技术总体上涉及免疫学领域。具体地，本专利技术涉及特异性结合人乳头瘤病毒E7的T细胞受体(下文中也缩写为TCR)、表达所述TCR的基因工程化细胞、以及制备所述基因工程化细胞的方法。本专利技术还涉及选择性扩增所述基因工程化细胞的方法，以及所述TCR和所述基因工程化细胞在预防和/或治疗人乳头瘤病毒感染中的用途。

技术介绍

[0002]人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一种小型的双链DNA病毒。在人类中，已经分离鉴定了超过200种类型的人乳头瘤病毒。在一些情况下，HPV可通过皮肤与皮肤接触传播并且是常见的性传播病毒。一些HPV亚型，例如HPV 16可导致宫颈癌和其他癌症。
[0003]根据诱发病变的性质不同，可以将HPV分类为诱发恶性肿瘤的致癌型(包括HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68等高危型及HPV 26,30,53,66,67,69,70,73,82,85等可能及可疑高危型)，及诱发疣状增生等良性病变的低危型(包括HPV 6,7,11,13,32,40,42,44,61,62,72,74,81,83,84,86,87,89,90,91,106等)。
[0004]对HPV的致癌机制研究发现，HPV感染诱导细胞恶性转化的关键是，HPV的两个晚期基因E6和E7整合到宿主细胞基因组中，并在细胞中稳定表达E6和E7。HPV E6和E7通过分别结合并促进肿瘤抑制蛋白p53和视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)的降解而发挥病毒癌蛋白的作用(Yugawa，T.和Kiyono，T.，Reviews in medical virology 19：97
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113，2009)。由于HPV E6和E7在正常人体组织中并无表达，因此，HPV E6和E7可作为HPV相关肿瘤及癌前病变治疗的靶分子。鉴于HPV16是世界范围内的优势流行病毒型别，约53.5％的宫颈癌是由HPV16感染引起的，其余46.5％的宫颈癌由其它约22种高危型和可疑高危型HPV感染引起，因此，深入研究针对HPV16 E7的疫苗或药物具有重大意义。
[0005]目前，市场上已存在针对高危型HPV16、18型的2价HPV疫苗、针对高危型HPV16、18和针对低危型HPV6和11型的4价HPV疫苗、以及针对高危型HPV16、18、31、33、45、52、58和针对低危型HPV6和11型的9价HPV疫苗。通过接种所述HPV疫苗可以有效预防相关HPV感染所引发的癌症。但是，对于在接种HPV疫苗前已经感染HPV的人群，接种所述HPV疫苗不能清除HPV病毒。
[0006]另外，尽管受HPV感染的细胞表达HPV E6和E7，但是，研究显示在宫颈癌患者的外周血中没有或仅存在数量稀少的HPV16 E7特异性的淋巴细胞。考虑到细胞免疫应答在清除HPV病毒和受HPV病毒感染的细胞上发挥着重要的作用，预期提高人体中具备HPV E7特异性的淋巴细胞数量是治疗HPV感染的最行之有效的方法，本领域需要开发出针对HPV病毒特异性抗原的特异性淋巴细胞，例如，TCR
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T细胞、TCR
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NK细胞，来有效预防和治疗HPV感染。

技术实现思路

[0007]本专利技术人通过锐意研究，获得了能与人乳头瘤病毒E7特异性结合的T细胞受体(TCR)，并制备了重组表达该TCR的淋巴细胞，由此，能够通过细胞免疫应答来清除人体内的
HPV病毒和被HPV病毒感染的细胞，从而满足了上述需求。
[0008]因此，在一个方面，本专利技术提供了分离的或纯化的T细胞受体(TCR)，其与人乳头瘤病毒E7特异性结合，优选地，所述TCR包含α链和β链，其中所述α链和β链各包含三个互补决定区(CDR)，并且α链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21和与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体，β链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO:80、83、86、89、92、95、98和与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体。
[0009]在一个实施方案中，本专利技术的TCRα链的CDR3的氨基酸序列和β链的CDR3的氨基酸序列是：
[0010](i)SEQ ID NO:3所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:80所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
[0011](ii)SEQ ID NO:6所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:83所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
[0012](iii)SEQ ID NO:9所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:86所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
[0013](iv)SEQ ID NO:12所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:89所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
[0014](v)SEQ ID NO:15所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:92所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
[0015](vi)SEQ ID NO:18所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:95所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；或
[0016](vii)SEQ ID NO:21所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:98所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体。
[0017]在一个实施方案中，本专利技术的TCR的α链包含的三个互补决定区(CDR)的氨基酸序列和β链包含的三个CDR的氨基酸序列是：
[0018](i)SEQ ID NO:1、2、3所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:78、79、80所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
[0019](ii)SEQ ID NO:4、5、6所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:81、82、83所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.分离的或纯化的T细胞受体，所述T细胞受体也简称为TCR，其特征在于，与人乳头瘤病毒E7特异性结合，所述TCR包含α链和β链，其中所述α链和β链各包含三个互补决定区，所述互补决定区也简称为CDR，并且α链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21和与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体，β链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO:80、83、86、89、92、95、98和与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体。2.根据权利要求1所述的TCR，其中，所述α链的CDR3的氨基酸序列和β链的CDR3的氨基酸序列是：(i)SEQ ID NO:3所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:80所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；(ii)SEQ ID NO:6所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:83所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；(iii)SEQ ID NO:9所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:86所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；(iv)SEQ ID NO:12所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:89所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；(v)SEQ ID NO:15所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:92所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；(vi)SEQ ID NO:18所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:95所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；或(vii)SEQ ID NO:21所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:98所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；优选地，所述α链的CDR3的氨基酸序列和β链的CDR3的氨基酸序列是：(i)SEQ ID NO:3所示的α链CDR3氨基酸序列和SEQ ID NO:80所示的β链CDR3氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO:6所示的α链CDR3氨基酸序列和SEQ ID NO:83所示的β链CDR3氨基酸序列；(iii)SEQ ID NO:9所示的α链CDR3氨基酸序列和SEQ ID NO:86所示的β链CDR3氨基酸序列；(iv)SEQ ID NO:12所示的α链CDR3氨基酸序列和SEQ ID NO:89所示的β链CDR3氨基酸序列；(v)SEQ ID NO:15所示的α链CDR3氨基酸序列和SEQ ID NO:92所示的β链CDR3氨基酸序列；
(vi)SEQ ID NO:18所示的α链CDR3氨基酸序列和SEQ ID NO:95所示的β链CDR3氨基酸序列；或(vii)SEQ ID NO:21所示的α链CDR3氨基酸序列和SEQ ID NO:98所示的β链CDR3氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的TCR，其中，所述α链包含的三个CDR的氨基酸序列和β链包含的三个CDR的氨基酸序列是：(i)SEQ ID NO:1、2、3所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:78、79、80所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；(ii)SEQ ID NO:4、5、6所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:81、82、83所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；(iii)SEQ ID NO:7、8、9所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:84、85、86所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；(iv)SEQ ID NO:10、11、12所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:87、88、89所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；(v)SEQ ID NO:13、14、15所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:90、91、92所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；(vi)SEQ ID NO:16、17、18所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:93、94、95所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；或(vii)SEQ ID NO:19、20、21所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:96、97、98所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体。4.根据权利要求3所述的TCR，其中，所述α链包含的三个CDR的氨基酸序列和β链包含的三个CDR的氨基酸序列是：(i)SEQ ID NO:1、2、3所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO:78、79、80所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO:4、5、6所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO:81、82、83所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；(iii)SEQ ID NO:7、8、9所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO:84、85、86所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；(iv)SEQ ID NO:10、11、12所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO:87、88、89所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；(v)SEQ ID NO:13、14、15所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO:90、91、92所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(vi)SEQ ID NO:16、17、18所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO:93、94、95所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；或(vii)SEQ ID NO:19、20、21所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO:96、97、98所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列。5.根据权利要求1至4中任一项所述的TCR，其中，所述TCR还包含恒定区，例如，所述恒定区是小鼠恒定区；优选地，所述TCR包含SEQ ID NO:64、66、68、70、72、74或76所示的α链序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；和SEQ ID NO:155、157、159、161、163、165或167所示的β链序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。6.核酸分子，其特征在于，编码权利要求1－5中任一项所述的TCR，优选地，所述核酸分子是密码子优化的、编码权利要求1－5中任一项所述的TCR的核苷酸序列。7.载体，其特征在于，包含权利要求6所述的核酸分子，所述载体优选地为质粒、穿梭质粒、噬菌粒、粘粒、表达载体；更优选地为同源重组修复(HDR)载体或病毒载体，例如，慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、杆状病毒载体。8.T细胞受体融合蛋白或T细胞受体缀合物，其包含权利要求1－5中任一项所述的TCR和其他生物活性分子，其中所述其他生物活性分子是例如抗体、细胞因子、细胞毒性剂、酶、放射性物质、可检测标记，其中所述TCR和其他生物活性分子之间具有或不具有接头。9.一种编辑人细胞基因组的方法，所述方法包括将以下核酸序列插入人细胞中内源性T细胞受体(TCR)α链恒定区基因的外显子1的靶区域中，所述核酸序列从N端到C端包含：(i)编码第一可裂解接头多肽的序列；(ii)编码权利要求1－5中任一项所述TCR的β链的序列；(iii)编码第二可裂解接头多肽的序列；(iv)编码权利要求1－5中任一项所述TCR的α链可变区的序列；其中，所述第一可裂解接头多肽和所述第二可裂解接头多肽是相同或不同的病毒2A肽；例如，所述核酸序列从N端到C端包含：(i)编码第一可裂解接头多肽的序列；(ii)编码第一信号肽和权利要求1－5中任一项所述TCR的β链的序列；(iii)编码第二可裂解接头多肽的序列；(iv)编码第二信号肽和权利要求1－5中任一项所述TCR的α链可变区的序列；例如，所述第一可裂解接头多肽和所述第二可裂解接头多肽是相同或不同的可裂解接头多肽，例如，2A核糖体跳跃元件例如T2A、E2A、P2A和F2A；所述第一信号肽和所述第二信号肽是相同或不同的信号肽；例如，通过将包含所述核酸序列的病毒载体引入细胞或者将所述核酸序列通过同源定向DNA修复而插入人细胞中内源性T细胞受体(TCR)α链恒定区基因的外显子1的靶区域中；例如，所述人细胞是人T细胞、NK细胞、干细胞，例如多能干细胞、诱导的多能干细胞(iPSC)。10....

【专利技术属性】
技术研发人员：彭松明，安多，钟山，常士伟，
申请(专利权)人：新景智源生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：