[课题]本发明专利技术提供一种通过导入了从肿瘤组织浸润CD106阳性T细胞分离的TCR的iPS细胞生产再生T细胞的方法。[解决方案]一种通过iPS细胞生产再生T细胞的方法，所述方法包括：1：从作为自受试者获得的T细胞的、对肿瘤相关抗原具有反应性且CD106阳性T细胞群中，在各单个细胞中制备分别编码T细胞受体α链和β链的cDNA的步骤；2：将B细胞和T细胞已被去除的受试者的外周血单核细胞或T细胞初始化为iPS细胞，并从由此获得的iPS细胞中筛选向T细胞的分化效率高的iPS细胞克隆的步骤；3：将所述cDNA导入所述iPS细胞克隆、由所述iPS细胞克隆分化出的造血干细胞、由所述造血干细胞分化出的未成熟T细胞或由所述未成熟T细胞分化出的成熟T细胞的步骤；和4：将在步骤(3)中获得并且已经将所述cDNA导入其中的所述iPS细胞克隆、所述造血干细胞或所述未成熟T细胞分化为所述成熟T细胞并增殖所述成熟T细胞的步骤。胞并增殖所述成熟T细胞的步骤。胞并增殖所述成熟T细胞的步骤。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】rejuvenated iPSC
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derived T cells improves their use in cancer immunotherapy.Cell Stem Cell.2018；23:850
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858.
技术实现思路
[0013]本专利技术所要解决的问题
[0014]在使用通过iPS细胞生产的再生T细胞(iPS
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T细胞)进行的癌症治疗中，使用特异性识别肿瘤细胞或肿瘤组织中存在的目标抗原的iPS
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T细胞对于确保iPS
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T细胞替代疗法在癌症治疗中的安全性和有效性很重要。此外，当检测到癌症的发病或复发时，重要的是快速开始iPS
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T细胞替代疗法，以改善治疗结果。
[0015]本专利技术的目的是提供一种用于快速生产已经导入从肿瘤组织浸润CD106阳性T细胞中分离的TCR的iPS
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T细胞的方法，以及根据所述方法生产的iPS
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T细胞。此外，本专利技术的另一目的是提供根据所述方法生产的iPS
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T细胞、包含所述iPS
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T细胞的药物组合物、以及使用所述药物组合物预防或治疗癌症的方法。
[0016]在最近的研究中发现，即使对于一个抗原表位，多个T细胞克隆(5至10个克隆)也分别通过使用不同的TCR识别抗原。目前，在获自患者的细胞中获得iPS
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T细胞的过程中，要维持所有抗原特异性T细胞克隆是极其困难的。此外，分化为iPS
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T细胞的克隆作为具有杀伤目标的最佳TCR的T细胞克隆的可能性受到从中采取用于生产iPS
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T细胞的细胞的受试者的个体差异或生产iPS
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T细胞的批次的影响。此外，为了分离特异性识别肿瘤的T细胞，需要向患者施予肿瘤抗原或在试管内进行T细胞和肿瘤抗原的共培养，但如果肿瘤抗原不明，则采用这种方法极其困难。
[0017]目前，使用在获自患者的细胞中获得的iPS细胞克隆来生产iPS
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T细胞需要很长时间。为了快速为需要其的患者提供iPS
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T细胞替代疗法，缩短生产周期是一个主要问题。
[0018]解决问题的方法
[0019]本专利技术人等发现，从肿瘤组织分离的CD106阳性T细胞群是识别肿瘤相关抗原的T细胞群，能够对癌细胞具有特异性攻击性，能够从这些识别肿瘤相关抗原的T细胞群中取得具有抗原特异性的各种TCR池，能够通过向由非T非B细胞或单核细胞或T细胞建立的iPS细胞导入TCR来制造iPS
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T细胞，通过预先筛选具有良好的向T细胞的分化效率的iPS细胞克隆，可以使再生T细胞的质量均质化，并缩短生产周期，同时，通过调整获取所述TCR池和建立iPS细胞的时机，可以迅速生产所述iPS
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T细胞，并且所述TCR池和所述非T非B细胞、单核细胞或T细胞可源自相同的个体或源自不同的个体，因此，完成了本专利技术。
[0020]即本专利技术的目的通过以下专利技术来实现。
[0021][1][0022]一种通过iPS细胞生产再生T细胞的方法，包括：
[0023](1)从作为自受试者获得的T细胞的对肿瘤相关抗原具有反应性且CD106阳性的T细胞群中，在各单个细胞中制备分别编码T细胞受体α链和β链的cDNA的步骤；
[0024](2)将作为受试者的外周血单核细胞的已被去除B细胞和T细胞的外周血单核细胞或T细胞初始化为iPS细胞，并从由此获得的iPS细胞中筛选向T细胞的分化效率高的iPS细胞克隆的步骤；
[0025](3)将所述cDNA导入所述iPS细胞克隆、由所述iPS细胞克隆分化出的造血干细胞、
由所述造血干细胞分化出的未成熟T细胞或由所述未成熟T细胞分化出的成熟T细胞的步骤；和
[0026](4)将在步骤(3)中获得并且已经将所述cDNA导入其中的所述iPS细胞克隆、所述造血干细胞或所述未成熟T细胞分化为成熟T细胞并增殖所述成熟T细胞的步骤。
[0027][2][0028]根据[1]所述的方法，其中所述步骤(2)在步骤(1)之前或与步骤(1)并行进行。
[0029][3][0030]根据[1]或[2]所述的方法，其中所述步骤(1)和(2)中的受试者是相同的个体。
[0031][4][0032]根据[1]或[2]所述的方法，其中所述步骤(1)和(2)中的受试者是不同的个体，并且步骤(2)中的受试者是癌症预防或治疗的对象。
[0033][5][0034]根据[1]或[2]所述的方法，其中所述步骤(1)和(2)中的受试者是不同的个体，并且步骤(1)中的受试者是癌症预防或治疗的对象。
[0035][6][0036]根据[1]或[2]所述的方法，其中所述步骤(1)和(2)中的受试者是相同的个体或不同的个体，并且与步骤(1)和(2)中的受试者不同的受试者是癌症预防或治疗的对象。
[0037][7][0038]根据[1]或[2]所述的方法，还包括以下步骤：从将步骤(4)中获得的所述cDNA导入的T细胞中筛选对来自作为癌症预防或治疗对象的受试者的细胞不表现出同种异体反应(alloreaction)的T细胞。
[0039][8][0040]根据[1]或[2]所述的方法，还包括以下步骤：从步骤(1)中制备的cDNA中筛选编码对来自作为癌症预防或治疗对象的受试者的细胞不诱导同种异体反应的T细胞受体的cDNA。
[0041][9][0042]根据[7]或[8]中所述的方法，其中来自作为癌症预防或治疗对象的受试者的所述细胞是外周血单核细胞。
[0043][10][0044]根据[1]至[9]中任一项所述的方法，其中在步骤(3)中使用病毒载体、非病毒载体或基因组编辑技术将所述cDNA导入所述iPS细胞克隆、从所述iPS细胞克隆分化的所述造血干细胞、从所述造血干细胞分化的所述未成熟T细胞、或从所述未成熟T细胞分化的所述成熟T细胞。
[0045][11][0046]根据[10]所述的方法，其中所述基因组编辑技术是CRISPR/Cas9或TALEN。
[0047][12][0048]根据[10]所述的方法，其中所述非病毒载体是转座子载体。
[0049][13][0050]根据[12]所述的方法，其中所述转座子载体是piggyBac(注册商标)载体。
[0051][14][0052]根据[1]至[13]中任一项所述的方法，其中在步骤(4)中，在饲养细胞和PHA(植物血凝素)的存在下、在RetroNectin(注册商标)和抗CD3抗体存在下、或在抗CD3抗体和抗CD28抗体存在下，将导入了所述cDNA的所述iPS细胞克隆、所述造血干细胞或所述未成熟T细胞分化为成熟T细胞，并使所述成熟T细胞增殖。
[0053][15][0054]根据[14]所述的方法，其中所述饲养细胞为自体或异体外周血单核细胞。
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种通过iPS细胞生产再生T细胞的方法，包括：(1)在作为自受试者获得的T细胞的对肿瘤相关抗原具有反应性且CD106阳性T细胞群中，在各单个细胞中制备分别编码T细胞受体α链和β链的cDNA的步骤；(2)将B细胞和T细胞已被去除的受试者的外周血单核细胞或T细胞初始化为iPS细胞，并从由此获得的iPS细胞中筛选向T细胞的分化效率高的iPS细胞克隆的步骤；(3)将所述cDNA导入所述iPS细胞克隆、由所述iPS细胞克隆分化出的造血干细胞、由所述造血干细胞分化出的未成熟T细胞或由所述未成熟T细胞分化出的成熟T细胞的步骤；和(4)将在步骤(3)中获得并且已经将所述cDNA导入其中的所述iPS细胞克隆、所述造血干细胞或所述未成熟T细胞分化为所述成熟T细胞并增殖所述成熟T细胞的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(2)在步骤(1)之前或与步骤(1)并行进行。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述步骤(1)和(2)中的受试者是相同的个体。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述步骤(1)和(2)中的受试者是不同的个体，并且步骤(2)中的受试者是癌症预防或治疗的对象。5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述步骤(1)和(2)中的受试者是不同的个体，并且步骤(1)中的受试者是癌症预防或治疗的对象。6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述步骤(1)和(2)中的受试者是相同的个体或不同的个体，并且与步骤(1)和(2)中的受试者不同的受试者是癌症预防或治疗的对象。7.根据权利要求1或2所述的方法，还包括以下步骤：从导入了步骤(4)中获得的所述cDNA的T细胞中筛选对来自作为癌症预防或治疗对象的受试者的细胞不表现出同种异体反应的T细胞。8.根据权利要求1或2所述的方法，还包括以下步骤：从步骤(1)中制备的cDNA中筛选编码对来自作为癌症预防或治疗对象的受试者的细胞不诱导同种异体反应的T细胞受体的cDNA。9.根据权利要求7或8所述的方法，其中来自作为癌症预防或治疗对象的受试者的所述细胞是外周血单核细胞。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中在步骤(3)中使用病毒载体、非病毒载体或基因组编辑技术将所述cDNA导入所述iPS细胞克隆、由所述iPS细胞克隆分化的所述造血干细胞、由所述造血干细胞分化的所述未成熟T细胞、或由所述未成熟T细胞分化的所述成熟T细胞。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述基因组编辑技术是CRISPR/Cas9或TALEN。12.根据权利要求10所述的方法，其中所述非病毒载体是转座子载体。...
【专利技术属性】
技术研发人员：金子新，五之坪良辅，大泽光次郎，等泰道，山下和男，N，
申请(专利权)人：弘泰生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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