一种利用实时荧光定量PCR鉴别威灵仙的引物探针组及其鉴别方法技术

本发明专利技术属于药物掺伪检测领域，具体涉及一种利用实时荧光定量PCR鉴别威灵仙的引物探针组及其鉴别方法。本发明专利技术提供的引物探针组为：上游引物：5'

【技术实现步骤摘要】
一种利用实时荧光定量PCR鉴别威灵仙的引物探针组及其鉴别方法


[0001]本专利技术属于药物掺伪检测领域，具体涉及一种利用实时荧光定量PCR鉴别威灵仙的引物探针组及其鉴别方法。

技术介绍

[0002]威灵仙为毛茛科植物威灵仙Clematis chinensis Osbeck、棉团铁线莲Clematis hexapetala Pall.或东北铁线莲Clematis manshurica Rupr.的干燥根和根茎。威灵仙主要以野生为主，但随着过度开采和市场需求逐渐增加，市场上的混伪品数量和种类也日趋增加，常见混伪品在性状方面与威灵仙药材极其相似，传统鉴别方法不能准确快速鉴别，且也无法进行定量检测，因此，建立一种可以准确高效的对市场中的威灵仙药材进行鉴别的方法成为了亟待解决的问题。

技术实现思路

[0003]针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种利用实时荧光定量PCR鉴别威灵仙的引物探针组，从分子生物学角度DNA层面对威灵仙及其常见混伪品进行鉴别，建立了实时荧光定量PCR方法，该方法简单、快捷，通过设计特异性引物及探针，对威灵仙和其他常见混伪品进行鉴别，专属性强，结果准确，耐用性好，且能够实现相对定量检测。
[0004]本专利技术还提供了一种利用上述引物探针组鉴别威灵仙的方法。
[0005]本专利技术为了实现上述目的所采用的技术方案为：
[0006]本专利技术提供了一种利用实时荧光定量PCR鉴别威灵仙的引物探针组，所述引物探针组为：
[0007]上游引物(如SEQ ID NO.1所示)：
[0008]5'
‑
TTTAGGAACATATTATATTGGAT
‑
3'；
[0009]下游引物(如SEQ ID NO.2所示)：
[0010]5'
‑
AAAAATGACTCGAATGGGG
‑
3'；
[0011]探针(如SEQ ID NO.3所示)：
[0012]5'JOE
‑
TCAAGAATTCAACAACCAATCCCCC
‑
BQ1 3'。
[0013]进一步的，所述引物探针组特异性识别的威灵仙的基因序列(如SEQ ID NO.4所示)为：
[0014]ACCCGCTTTCTCAAATAAATTGTTTCAAAATTTTTAGGAACATATTATATT
[0015]GGATTGGTTTATATATGTACAGAACGAGAGTATGATAATCAAGAATTCAA
[0016]CAACCAATCCCCCATTCGAGTCATTTTTTTTTTTTTTACTTCAAATTAAAAA
[0017]AGTCAATTACTTCAAAAAAAAAAAAGAAAAAATCATTATGAAAAATGCA
[0018]AATAAAACACTATTAAAACAAAACGCAGGAGCAATGCCCGGCCTCTTGAC
[0019]AGAACAAGAATTGGGGTATTACTCCTGCAACTTCAACGACTCATATACACTAAGACTAGCATACACTA
AGACCTAAGTCTTAGCCATTTGTA。
[0020]本专利技术还提供了一种含有上述引物探针组的检测试剂盒。
[0021]本专利技术的另一目的为提供了利用上述引物探针组鉴别威灵仙的方法，包括以下步骤：
[0022](1)提取待测样品的模板DNA；
[0023](2)PCR反应体系配制：总体积为20μl，分别加入荧光PCR反应混合液(2
×
)10μl，探针(0.8μmol/L)1μL，上下游引物(3μmol/L)各1μL，供试品溶液0.5μL，灭菌超纯水6.5μL；
[0024](3)对照反应体系为用等体积对照药材溶液代替供试品溶液的反应体系；空白对照反应体系为用等体积灭菌超纯水代替供试品溶液的反应体系；供试品及对照均设三个重复，CT值取三个重复的平均值作为最终结果；
[0025](4)PCR反应，可进行定性检查，也可根据标准曲线进行相对定量。
[0026]进一步的，步骤(1)中，所述模板DNA的提取方法为：取待测样品粉末40mg，置1.5ml离心管中，用植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA，取洗脱液，作为供试品溶液，置
‑
20℃保存备用。
[0027]进一步的，所述PCR反应的参数为：阶段1：95℃，3分钟；阶段2：95℃，10秒，60℃，35秒，35个循环。
[0028]进一步的，鉴别过程中的判定原则为：
[0029](1)无荧光对数增长，或有荧光对数增长但相应的CT值≥35.0，视为未检出威灵仙；
[0030](2)有荧光对数增长，且相应的CT值＜32.0，视为检出威灵仙。有荧光对数增长，且相应的CT值32.0≤Ct＜35.0时，则重复1次，若再次扩增后仍有荧光对数增长，且Ct＜35.0，则视为检出威灵仙。
[0031]本专利技术的待检样品为毛茛科植物威灵仙Clematis chinensis Osbeck、棉团铁线莲Clematis hexapetala Pall.或东北铁线莲Clematis manshurica Rupr.的干燥根和根茎及以上述三个物种原粉入药的中成药。
[0032]【炮制】除去杂质，洗净，润透，切段，干燥。
[0033]【性状】本品呈不规则的段。表面黑褐色、棕褐色或棕黑色，有细纵纹，有的皮部脱落，露出黄白色木部。切面皮部较广，木部淡黄色，略呈方形或近圆形，皮部与木部间常有裂隙。
[0034]本专利技术采用植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA的具体过程中：加入65℃预热GP1缓冲液700μl，涡旋混匀，在恒温振荡混匀仪中65℃振荡裂解4～6h，加入氯仿700μl离心(12000rpm)5min，将上清液转移至另一1.5ml离心管中，加入缓冲液GP2 700μL涡旋混匀；混匀后转入到CB3吸附柱中，离心(12000rpm)30秒，弃去过滤液，加入GD缓冲液500μL，离心(12000rpm)30秒，倒掉废液，加入600μl漂洗液PW，离心(12000rpm)30秒，倒掉废液，再次加入600μl漂洗液PW，离心(12000rpm)30秒，倒掉废液，离心2min，将CB3吸附柱转移至新的离心管中，室温放置10～15min后，加入80μl TE洗脱缓冲液，室温放置2min，离心(12000rpm)2min。
[0035]PCR检测过程中，质量要求：实验应同时满足以下条件：(1)空白对照无荧光对数增长或相应的CT值≥35.0；(2)阳性对照有荧光对数增长，且相应的CT值＜35.0。
[0036]本专利技术的有益效果为：本专利技术利用实时荧光PCR鉴别方法，基于SNP位点差异，设计特异性引物及探针，对威灵仙和其他常见混伪品进行鉴别，该方法专属性强，结果准确，耐用性好。
附图说明
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用实时荧光定量PCR鉴别威灵仙的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组为：上游引物：5'
‑
TTTAGGAACATATTATATTGGAT
‑
3'；下游引物：5'
‑
AAAAATGACTCGAATGGGG
‑
3'；探针：5'JOE
‑
TCAAGAATTCAACAACCAATCCCCC
‑
BQ1 3'。2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组特异性识别的威灵仙的基因序列为：ACCCGCTTTCTCAAATAAATTGTTTCAAAATTTTTAGGAACATATTATATTGGATTGGTTTATATATGTACAGAACGAGAGTATGATAATCAAGAATTCAACAACCAATCCCCCATTCGAGTCATTTTTTTTTTTTTTACTTCAAATTAAAAAAGTCAATTACTTCAAAAAAAAAAAAGAAAAAATCATTATGAAAAATGCAAATAAAACACTATTAAAACAAAACGCAGGAGCAATGCCCGGCCTCTTGACAGAACAAGAATTGGGGTATTACTCCTGCAACTTCAACGACTCATATACACTAAGACTAGCATACACTAAGACCTAAGTCTTAGCCATTTGTA。3.一种含有如权利要求1或2所述的引物探针组的检测试剂盒。4.一种利用权利要求1或2所述的引物探针组定量鉴别威灵仙的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪冰，林永强，解盈盈，刘丽，刘洪超，周倩倩，穆向荣，臧远芳，梅桂雪，王晓彤，刘杰，薛菲，
申请(专利权)人：山东省食品药品检验研究院，
类型：发明
国别省市：