狗牙根铝响应基因及其引物和克隆方法技术

本发明专利技术公开了狗牙根铝响应基因及其引物和克隆方法，属于植物基因工程技术领域。狗牙根铝响应基因，所述基因为CdMATE1和CdSTAR1，CdMATE1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，CdSTAR1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。扩增CdMATE1基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；扩增CdSTAR1基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。克隆方法包括铝胁迫处理、扩增全长序列、PCR产物加A尾、连接反应、大肠杆菌转化和PCR验证菌落。本发明专利技术联合转录组学信息从基因层面解析了狗牙根的耐铝机制，有利于狗牙根耐铝机制的研究、育种与应用。育种与应用。育种与应用。

【技术实现步骤摘要】
狗牙根铝响应基因及其引物和克隆方法


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及狗牙根铝响应基因及其引物和克隆方法。

技术介绍

[0002]狗牙根(Cynodondactylon(Linnaeus)Persoon)是禾本科多年生草本植物，是我国南方地区天然草地上最常见的草种之一。狗牙根耐践踏，繁殖和再生能力强，可用于公路护坡、庭院绿化和高尔夫球场等；叶量丰富，饲口性好，也可作为优质牧草饲养牛羊等草食动物。
[0003]现有对狗牙根铝胁迫的研究发现随着铝胁迫浓度的增加，狗牙根根尖苏木精染色范围从根尖扩大且染色程度加深，此外根系的铝含量也有所增加，表明根尖是植物受到铝胁迫的初始部位。铝胁迫下狗牙根的叶绿素含量降低，叶色变浅，可溶性总糖含量降低等；此外，抗氧化酶活性的增强可以减轻铝胁迫对狗牙根的毒害作用，表现为活性氧、氧化物酶和游离脯氨酸的含量增加。这些研究都停留在种质评价及生理机制层面，无法进一步说明狗牙根耐铝的自身优势，局限了狗牙根的进一步推广和利用，因此，急需挖掘狗牙根铝响应基因，从基因层面对狗牙根的耐铝机制进行研究。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点，提供狗牙根铝响应基因及其引物和克隆方法。
[0005]本专利技术的目的通过以下技术方案来实现：狗牙根铝响应基因，所述基因为CdMATE1和CdSTAR1，CdMATE1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，CdSTAR1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0006]用于扩增狗牙根铝响应基因的引物，扩增CdMATE1基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；扩增CdSTAR1基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0007]狗牙根铝响应基因的克隆方法，它包括以下步骤：
[0008]S1.铝胁迫处理：对耐铝狗牙根种质A22进行水培生根，挑选根长5cm左右、长势一致的苗放入铝处理液中进行铝胁迫处理，处理24h后收集根系；其中，所述铝处理液为氯化钙和氯化铝的混合溶液，混合溶液中氯化钙的浓度为450～550μM，氯化铝的浓度为450～550μM，铝处理液的pH值为3.5～4.5；
[0009]S2.扩增全长序列：以步骤S1中铝胁迫处理24h后狗牙根的根系cDNA为模板，采用上述的引物，用高保真酶GXL分别进行PCR扩增目的片段，PCR扩增完成后进行电泳检测并回收CdMATE1和CdSTAR1片段；
[0010]S3.PCR产物加A尾：使用DNAA
‑
Tailing Kit试剂盒在PCR产物的3
’
末端加上poly(A)尾巴，分别得加A尾的CdMATE1基因和加A尾的CdSTAR1基因；
[0011]S4.连接反应：用限制性内切酶XcmI对质粒pCXSN
‑
Myc进行酶切反应，电泳检测酶切产物，并回收对应片段，使用T4连接酶分别将加A尾的CdMATE1质粒和加A尾的CdSTAR1基因连接到线性化的植物表达载体pCXSN
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Myc上，所得产物即为重组质粒pCXSN
‑
Myc
‑
CdMATE1和pCXSN
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Myc
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CdSTAR1；
[0012]S5.大肠杆菌转化：分别将重组质粒pCXSN
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Myc
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CdMATE1和pCXSN
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Myc
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CdSTAR1加入大肠杆菌感受态细胞Trans T1中，加入LB培养基培养50～70min，取菌液涂在含卡那霉素的LB固体培养基上，倒置培养12～16h；
[0013]S6.PCR验证菌落：检测步骤S5中固体培养基培养的菌落产物，选取阳性克隆的菌落置于含卡那霉素的LB液体培养基中扩大培养后，挑选阳性克隆的菌液进行测序分析，获得CdMATE1和CdSTAR1全长cDNA序列。
[0014]进一步地，步骤S1中所述水培生根的具体操作为：剪取耐铝狗牙根种质A22的匍匐茎段，茎节浸没在营养液中进行水培生根，所述营养液为1/2Hoagland营养液，pH值为5.8。
[0015]进一步地，步骤S2中所述PCR扩增的体系为：5
×
PS GXLBuffer：10μL，2.5mM dNTP mix：1.6μL，Forward primer：0.5μL，Reverse primer：0.5μL，稀释20倍的cDNA：1μL，GXL Enzyme：0.4μL，ddH2O：12μL，Total：20μL；
[0016]PCR反应参数为：
[0017][0018]进一步地，步骤S3中加A尾的反应体系为：10
×
A
‑
Tailing Buffer：5μL，2.5mM dNTPmix：4μL，A
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Tailing Enzyme：0.5μL，0.5～5μg末端平滑DNA片段：10μL，ddH2O：30.5μL，Total：50μL；反应条件：72℃，20min；放冰上2min；4℃保存。
[0019]进一步地，步骤S4中所述酶切反应的反应体系为：plasmid：3μg(xμL)，10
×
NEB Buffer：3μL，XcmI：1μL，ddH2O：(26
‑
x)μL，Total：30μL；反应条件：37℃反应3h以上。
[0020]进一步地，步骤S4中所述线性化的植物表达载体pCXSN
‑
Myc的连接体系为：50ng Vector：1μL，50ng Insert DNA：2μL，10
×
T4ligase Buffer：1μL，5U/L T4 ligase：1μL，ddH2O：6μL，Total：10μL；反应条件：4℃反应过夜。
[0021]进一步地，步骤S6中采用1％琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR产物，菌落PCR的反应体系为：2
×
Green r Taq mix：10μL，
[0022]Forwardprimer：0.5μL：Reverse primer：0.5μL：模板：2μL，ddH2O：7μL，Total：20μL；菌落PCR反应参数如下：
[0023][0024]本专利技术具有以下优点：本专利技术公开的基因CdMATE1和CdSTAR1是根据铝胁迫条件下对转录组测序结果，经RT
‑
PCR验证，这两个基因在铝胁迫下，在耐铝材料和不耐铝材料中都是差异上调的基因，且在NCBI里比对确定有全长的基因。本专利技术进一步公开了狗牙根铝响应基因的克隆方法，并且本专利技术联合转录组学信息从基因层面解析了狗牙根的耐铝机制，有利于狗牙根耐铝机制的研究、育种与应用。
附图说明
[0025]图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.狗牙根铝响应基因，其特征在于，所述基因为CdMATE1和CdSTAR1，CdMATE1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，CdSTAR1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.根据权利要求1所述的用于扩增狗牙根铝响应基因的引物，其特征在于，扩增CdMATE1基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；扩增CdSTAR1基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。3.根据权利要求1所述的狗牙根铝响应基因的克隆方法，其特征在于，它包括以下步骤：S1.铝胁迫处理：对耐铝狗牙根种质A22进行水培生根，挑选根长5cm左右、长势一致的苗放入铝处理液中进行铝胁迫处理，处理24h后收集根系；其中，所述铝处理液为氯化钙和氯化铝的混合溶液，混合溶液中氯化钙的浓度为450～550μM，氯化铝的浓度为450～550μM，铝处理液的pH值为3.5～4.5；S2.扩增全长序列：以步骤S1中铝胁迫处理24h后狗牙根的根系cDNA为模板，采用权利要求2所述的引物，用高保真酶GXL分别进行PCR扩增目的片段，PCR扩增完成后进行电泳检测并回收CdMATE1和CdSTAR1片段；S3.PCR产物加A尾：使用DNAA
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Tailing Kit试剂盒在PCR产物的3
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末端加上poly(A)尾巴，分别得加A尾的CdMATE1基因和加A尾的CdSTAR1基因；S4.连接反应：用限制性内切酶XcmI对质粒pCXSN
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Myc进行酶切反应，电泳检测酶切产物，并回收对应片段，使用T4连接酶分别将加A尾的CdMATE1质粒和加A尾的CdSTAR1基因连接到线性化的植物表达载体pCXSN
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Myc上，所得产物即为重组质粒pCXSN
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Myc
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CdMATE1和pCXSN
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Myc
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CdSTAR1；S5.大肠杆菌转化：分别将重组质粒pCXSN
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Myc
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CdMATE1和pCXSN
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Myc
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CdSTAR1加入大肠杆菌感受态细胞Trans T1中，加入LB培养基培养50～70min，取菌液涂在含卡那霉素的LB固体培养基上，倒置培养12～16h；S6.PCR验证菌落：检测步骤S5中固体培养基培养的菌落产物，选取阳性克隆的菌落置于含卡那霉素的LB液体培养基中扩大培养后，挑选阳性克隆的菌液进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄春琼，段宏利，陈志坚，严琳玲，郇恒福，董荣书，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，
类型：发明
国别省市：