天麻萌发菌的脱毒筛选方法技术

本发明专利技术提供一种天麻萌发菌的脱毒筛选方法，属于脱毒技术领域，包括：对萌发菌的退化菌种进行活化的活化工序，将所得退化菌种在脱毒培养基中进行菌丝尖端脱毒循环得到脱毒菌种的脱毒工序，和对脱毒菌种进行扩殖培养的扩殖工序；菌丝尖端脱毒循环进行4

【技术实现步骤摘要】
天麻萌发菌的脱毒筛选方法


[0001]本专利技术涉及脱毒
，尤其涉及一种天麻萌发菌的脱毒筛选方法。

技术介绍

[0002]天麻为兰科天麻属多年生草本，根茎膨大，无根无叶，不能进行光合作用，靠与密环菌共生异养生活，主要分布于我国西南部秦巴山区、云贵高原和四川等地海拔700
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2800m的落叶阔叶林地。天麻以块茎入药，具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络、降压、降血脂、抗氧化、保肝、抗肿瘤、增强免疫力的功效。近年来，随着人们对天麻药用价值的了解，其市场需求量逐年增加，这对天麻的生产提出了新的挑战。
[0003]目前天麻的生产以有性繁殖为主，但天麻种子细小如尘，种子仅有种胚和种皮、无胚乳，难以独自萌发。自徐锦堂等发现小菇属(Mycenasp.)萌发菌可与天麻种子共生萌发以来，天麻的生产已有了较大发展。萌发菌是一类会发光的好氧真菌，主要营腐生生活，多腐生于林间枯枝落叶、朽枝、植物腐生根上。萌发菌与天麻种子拌播后，能和天麻种子形成特殊的共生关系，天麻种子萌发菌主要以菌丝的形态从种子胚柄细胞侵入种胚，为其提供种子萌发和生长所需的营养，萌发菌是天麻种子萌发的外营养来源，具有提高天麻种子萌发率的能力。到目前为止，报道的天麻种子萌发菌均属于小菇属的4种真菌，主要包括紫萁小菇Mycena osmundicola、兰小菇Mycena orchidicola、石斛小菇Mycena dendrobii和开唇兰小菇Mycenaanoectochila，其中，主要用于生产的萌发菌是石斛小菇和紫萁小菇这2种。
[0004]由于萌发菌和食用菌菌种一样，菌种保藏一般都用低温试管菌种的保藏方式，然而，菌种通过在低温保藏3
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5个月后要进行活化转接重新保存，这样在日常生活中，菌株经过长时间的低温保存和多次的转接，就会出现严重的退化现象，在培养中污染杂菌率也大大增加，从而导致萌发菌活力降低、遗传稳定性差。天麻种子萌发菌退化现象的主要表现在：菌丝体生长缓慢，颜色变暗，菌丝活力弱，侵染天麻种子的能力下降，主要是因为萌发菌经过的多代的转接和长时间保存不当引起的。在实际生产中，天麻有性繁殖的产量、品质等常常因萌发菌菌种退化而受到严重的影响，而萌发菌种质资源严重缺乏。已表现出退化现象的菌株必须进行复壮，进行菌种复壮时可采用以下方法：1)改善培养基的营养环境；2)诱导子实体并分离；3)菌丝尖端的脱毒；4)天麻原球茎的分离，并进行优良性状的比较和筛选。其中菌丝尖端的脱毒技术最为快速有效，但是也仍存在一些不足，如：菌丝尖端脱毒后，脱毒菌种的菌丝生长情况及胞外酶活性等方面虽然比退化菌种有显著恢复和提升，但与最初保存的母种菌种的性状比较仍有差距。因此，将退化的萌发菌菌种进行脱毒，并筛选出优质的萌发菌菌种，避免萌发菌菌种退化影响天麻生产效益就显得尤为迫切。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种脱毒效果佳，脱毒成功率能达到95％以上，脱毒菌种和扩殖菌种都能在萌发菌菌种保藏和天麻生产中应用，解决了萌发菌菌种的退化和长势减弱问题的天麻萌发菌的脱毒筛选方法。
[0006]本专利技术提供一种天麻萌发菌的脱毒筛选方法，包括：对萌发菌的退化菌种进行活化的活化工序，将活化工序所得退化菌种在脱毒培养基中进行菌丝尖端的脱毒循环得到脱毒菌种的脱毒工序，和对脱毒菌种进行扩殖培养的扩殖工序；菌丝尖端的脱毒循环进行4
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8次；脱毒工序的菌丝尖端的脱毒循环中，待转接培养的菌种的菌丝生长速度显著高于退化菌种的菌丝生长速度，且连续三次转接培养的菌种的菌丝生长速度差异不显著，即视为脱毒结束；扩殖工序得到的扩殖菌种用于保藏或天麻生产。
[0007]通过上述技术方案，萌发菌的退化菌种经活化、菌丝尖端脱毒循环和扩殖培养，脱毒成功率能达到95％以上，得到的扩殖菌种恢复了萌发菌菌种的优良性状，菌丝生长速度、外观及菌丝长势显著变化，具有优良的遗传稳定性，脱毒菌种解决了萌发菌菌种的退化和长势减弱的问题，所得扩殖菌种能在萌发菌菌种保藏和天麻生产中应用。
[0008]进一步设置为，活化工序的步骤为：将用石蜡封存的天麻萌发菌退化菌种接至PDA固体培养基上，于22
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26℃恒温下黑暗培养5
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8d，然后在相同培养条件下，转板2次，得到无石蜡残留的天麻萌发菌退化菌种。对保藏期的退化菌种进行活化，目的是打破退化菌种的休眠期，使得退化菌种能在脱毒培养基上快速适应环境并生长，有利于后期对菌丝尖端的剥离和脱毒处理。
[0009]进一步设置为，脱毒工序的步骤为：切取无石蜡残留的天麻萌发菌的退化菌种的菌落最边缘的幼嫩菌丝的尖端0.2
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0.5mm，接种至脱毒培养基中进行脱毒培养，并连续转接进行4
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8次脱毒循环，脱毒结束后，得到脱毒菌种。
[0010]进一步设置为，脱毒循环的过程如下：
[0011]1)将退化菌种接种于装有15mL脱毒培养基的60mm平皿中，于22
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26℃恒温培养，待菌落直径长至3
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4cm后，切取菌落最边缘幼嫩菌丝尖端0.2
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0.5mm转接在另一平皿中，再于22
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26℃恒温培养至菌落直径为平皿2/3时，完成第一次脱毒循环，得到第一次脱毒菌种；
[0012]2)将第一次脱毒菌种接种于装有15mL脱毒培养基的60mm平皿中，于22
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26℃恒温培养，待菌落直径长至3
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4cm后，切取菌落最边缘幼嫩菌丝尖端0.2
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0.5mm转接在另一平皿中，再于22
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26℃恒温培养至菌落直径为平皿2/3时，完成第二次脱毒循环，得到第二次脱毒菌种；
[0013]3)按步骤2)的方式再进行2
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6次连续转接和脱毒循环，且每次脱毒菌种的菌丝生长速度均与退化菌种的菌丝生长速度进行对比，检测脱毒效果，直至脱毒完成。
[0014]通过上述技术方案，经过4
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8次的菌丝尖端脱毒循环，完成脱毒的脱毒菌种的菌丝生长速度与退化菌种有显著差异，能有效恢复萌发菌菌种的生产能力，所得脱毒菌种的菌丝生长速度快、长势优，洁白、整齐且浓密，菌丝生长速度和萌发菌生物量也得到显著提升。
[0015]进一步设置为，脱毒培养基的原料包括：阔叶树木屑100
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200g、麦麸30
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70g、土豆200
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400g、葡萄糖10
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30g、磷酸二氢钾1
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5g、硫酸镁0.5
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3g、玉米粉15
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25g、天麻10
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20g、琼脂粉10
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30g和蒸馏水。在脱毒培养基中加入天麻的目的是提供萌发菌菌丝生长的特殊营养，并使得萌发菌在早期培养中就能适应天麻存在的环境条件，增加萌发菌与天麻共生的快速适应性，在萌发菌与天麻种子共生培养时，萌发菌能更快速地侵染天麻种子，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种天麻萌发菌的脱毒筛选方法，其特征在于，包括：对萌发菌的退化菌种进行活化的活化工序，将所述活化工序所得退化菌种在脱毒培养基中进行菌丝尖端的脱毒循环得到脱毒菌种的脱毒工序，和对所述脱毒菌种进行扩殖培养的扩殖工序；所述菌丝尖端的脱毒循环进行4
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8次；所述脱毒工序的菌丝尖端的脱毒循环中，待转接培养的菌种的菌丝生长速度显著高于退化菌种的菌丝生长速度，且连续三次转接培养的菌种的菌丝生长速度差异不显著，即视为脱毒结束；所述扩殖工序得到的扩殖菌种用于保藏或天麻生产。2.根据权利要求1所述的天麻萌发菌的脱毒筛选方法，其特征在于，所述活化工序的步骤为：将用石蜡封存的天麻萌发菌退化菌种接至PDA固体培养基上，于22
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26℃恒温下黑暗培养5
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8d，然后在相同培养条件下，转板2次，得到无石蜡残留的天麻萌发菌退化菌种。3.根据权利要求1所述的天麻萌发菌的脱毒筛选方法，其特征在于，所述脱毒工序的步骤为：切取无石蜡残留的天麻萌发菌的退化菌种的菌落最边缘的幼嫩菌丝的尖端0.2
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0.5mm，接种至脱毒培养基中进行脱毒培养，并连续转接进行4
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8次脱毒循环，脱毒结束后，得到脱毒菌种。4.根据权利要求1所述的天麻萌发菌的脱毒筛选方法，其特征在于，所述脱毒循环的过程如下：1)将退化菌种接种于装有15mL脱毒培养基的60mm平皿中，于22
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26℃恒温培养，待菌落直径长至3
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4cm后，切取菌落最边缘幼嫩菌丝尖端0.2
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0.5mm转接在另一平皿中，再于22
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26℃恒温培养至菌落直径为平皿2/3时，完成第一次脱毒循环，得到第一次脱毒菌种；2)将第一次脱毒菌种接种于装有15mL脱毒培养基的60mm平皿中，于22
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26℃恒温培养，待菌落直径长至3
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4cm后，切取菌落最边缘幼嫩菌丝尖端0.2
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0.5mm转接在另一平皿中，再于22
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26℃恒温培养至菌落直径为平皿2/3时，完成第二次脱毒循环，得到第二次脱毒菌种；3)按步骤2)的方式再进行2
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6次连续转接和脱毒循环，且每次脱毒菌种的菌丝生长速度均与退化菌种的菌丝生长速度进行对比，检测脱毒效果，直至脱毒完成。5.根据权利要求1
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4任一项所述的天麻萌发菌的脱毒筛选方法，其特征在于，所述脱毒培养基的原料包括：阔叶树木屑100
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【专利技术属性】
技术研发人员：马宝宏，解修超，马明元，刘万里，
申请(专利权)人：陕西森盛菌业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：