一种可应用于自体血管和小口径组织工程血管抗钙化的工程化外泌体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及组织工程血管技术领域，具体涉及一种可应用于自体血管和小口径组织工程血管抗钙化的工程化外泌体及其制备方法和应用。一种工程化外泌体，其表面修饰有E7间充质干细胞亲和肽；其内部包裹有lncRNA

【技术实现步骤摘要】
一种可应用于自体血管和小口径组织工程血管抗钙化的工程化外泌体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及组织工程血管
，具体涉及一种可应用于自体血管和小口径组织工程血管抗钙化的工程化外泌体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]心血管疾病的发病率和死亡率在全球范围内逐年上升。生物组织工程血管(TEBV)可以用于细胞重建，并最终在体内完全再细胞化，使它们成为血管替代治疗的有前途的候选材料。然而，TEBV植入后，平滑肌细胞(SMCs)的重建速度极其缓慢。平滑肌细胞对于维持血管的机械强度和血管的活性反应非常重要。在血管移植物中，随着平滑肌层的成功重建，弹性蛋白的分泌提供充足的ECM蛋白；多层的血管平滑肌细胞能够提供接近于自体动脉的收缩功能。在现有的组织工程血管移植物中，平滑肌细胞的异常重建往往导致内膜增生，血管中膜部位无法得到足够强度的平滑肌细胞支撑，移植物较低的机械强度将导致动脉瘤的发生。
[0003]另外，TEBV植入体内后，非常容易发生钙化现象。血管钙化(vascular calcification)是动脉粥样硬化、高血压、糖尿病血管病变、血管损伤、慢性肾病和衰老等普遍存在的共同的病理表现。主要表现为血管壁僵硬性增加，顺应性降低。血管壁内出现钙质沉积以及中膜平滑肌表型转化，都会导致血管弹性降低和变脆。血管壁的部分平滑肌细胞异常的表型变化可导致血管钙化。普遍认为，平滑肌细胞向成骨样细胞分化被认为是血管移植物重建过程中钙化的主要细胞来源，尤其在糖尿病等慢性疾病所加重的血管钙化中。由于TEBV的钙化最终导致移植物失败，发生率高达68％。目前还没有有效的方法来促进TEBV中SMCs的重建和抵抗体内长期的钙化。同时，血管钙化也是糖尿病、慢性肾脏疾病等最常见的并发症，因为相关的代谢和炎症因素加速了血管钙化。
[0004]基于上述组织工程血管研究开发过程中遇到的障碍，亟需采取有效手段寻找影响平滑肌重建以及血管钙化的作用靶点，进而研发新型制剂以提升组织工程血管移植成功率以及缓解血管钙化所造成的危害。

技术实现思路

[0005]本专利技术意在提供一种工程化外泌体，以解决现有技术中组织工程血管(TEBV)或者自体血管的平滑肌重建效率低且血管易发生钙化的技术问题。
[0006]为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种工程化外泌体，其表面修饰有E7间充质干细胞亲和肽；其内部包裹有lncRNA
‑
ANCR。
[0008]本技术方案还提供了一种工程化外泌体的制备方法，包括以下依次进行的步骤：
[0009]S1：构建表达E7
‑
lamp2b融合蛋白的质粒；
[0010]S2：使用所述质粒转染人骨髓间充质干细胞，获得表达细胞；诱导表达细胞分泌外
泌体，经分离纯化获得空载外泌体；
[0011]S3：将lncRNA
‑
ANCR导入空载外泌体中，获得工程化外泌体。
[0012]本技术方案还提供了一种工程化外泌体在制备组织工程血管中的应用。
[0013]本技术方案还提供了一种工程化外泌体在制备血管钙化抑制药物中的应用。
[0014]本技术方的原理以及有益效果在于：
[0015]本技术方案提供了一种可应用于自体血管和小口径组织工程血管抗钙化的工程化外泌体。该外泌体采用以下方法制备得到：将间充质干细胞亲和肽E7的基因序列定向插入到外泌体膜蛋白lamp2b的基因序列中获得融合蛋白表达载体。所制得的融合蛋白载体和包装质粒通过转染导入HuBM
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MSCs，并诱导表达获得外泌体。再通过电转染将长链非编码RNA
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ANCR负载到上述获取的E7外泌体中，最终获得工程化外泌体ANCR/E7
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EXO。工程化外泌体ANCR/E7
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EXO可以靶向Gli1
+
细胞，抑制其成骨分化以及促进血管中膜处的平滑肌细胞的形成。使用工程化外泌体处理组织工程血管，可以有效促进组织工程血管的移植成功。使用工程化外泌体给药至生物体，可以有效避免血管钙化的发生。
[0016]Gli1
+
细胞是血管钙化以及平滑肌细胞重建的关键靶点，这是专利技术人在本专利方案中首次发现并提出。血管钙化是长期以来威胁人体健康以及影响组织工程血管移植成功率的要素，其发生发展机制，其关键靶点，在现有技术中并没有相关报道。间充质基质细胞(MSCs)是周细胞的一种，位于多个人体器官的血管周围壁龛中。它们作为原始祖细胞的储存库，可能参与血管钙化和血管软骨化生。Gli1是血管MSCs的特异性选择性标记物之一，Gli1
+
细胞表达典型的MSC和成骨细胞标记物，具有三系分化能力。同时，Gli1
+
细胞是血管周围的MSCs亚群。经研究发现，在慢性血管损伤或糖尿病中，Gli1
+
细胞分化为成骨样细胞，是血管中膜和内膜钙化的原因。因此，阻止Gli1
+
细胞向成骨样细胞分化并促进其向SMC分化可能是抑制血管钙化、促进TEBV中平滑肌重建的关键靶点。
[0017]综上，本专利技术获取的工程化外泌体能够在体内靶向Gli1
+
细胞并调控其分化趋势，能够逆转慢性肾脏疾病所导致的血管钙化。其修饰的小口径组织工程血管能加速血管移植物的平滑肌层重建，在体内具有与天然血管相似的机械强度，并通过调节平滑肌祖细胞的分化有效抑制了正常和糖尿病情况下血管移植物的钙化。
[0018]进一步，所述E7
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lamp2b融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.3所示；lncRNA
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ANCR的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
[0019]采用上述技术方案，长链非编码RNA(Lnc
‑
RNA)在转录和转录后水平上调控蛋白质编码基因的表达，并在生长、发育和细胞定向分化的调节中发挥重要作用。在人成骨细胞分化过程中，IncRNA
‑
ANCR的表达通过增强子EZH2(18)的募集而抑制成骨细胞的分化。体外和体内实验均表明，沉默lncRNA
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ANCR促进了成骨细胞的成骨。现有技术并未报道ANCR是否也调节Gli1
+
细胞的成骨分化。本技术方案将lncRNA
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ANCR应用于Gli1
+
细胞的成骨分化的调控中，有效地促进了平滑肌重建以及抑制血管钙化。
[0020]E7肽对Gli1
+
细胞具有特殊的亲和力，促进Gli1
+
细胞归巢。因此将构建的E7载体导入人骨髓间充质干细胞(HuBM
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MSCs)，并通过电穿孔将ANCR导入到HuBM
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MSCs衍生的E7
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EXO中，构建工程化外泌体
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ANCR/E7
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EXO，可有效靶向Gli本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种工程化外泌体，其特征在于，其表面修饰有E7间充质干细胞亲和肽；其内部包裹有lncRNA
‑
ANCR。2.根据权利要求1所述的一种工程化外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下依次进行的步骤：S1：构建表达E7
‑
lamp2b融合蛋白的质粒；S2：使用所述质粒转染人骨髓间充质干细胞，获得表达细胞；诱导表达细胞分泌外泌体，经分离纯化获得空载外泌体；S3：将lncRNA
‑
ANCR导入空载外泌体中，获得工程化外泌体。3.根据权利要求2所述的一种工程化外泌体的制备方法，其特征在于，所述E7
‑
lamp2b融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.3所示；lncRNA
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ANCR的基因序列如SEQ ID NO.1所示。4.根据权利要求1所述的一种工程化外泌体在制备组织工程血管中的应用，其特征在于，包括以下依次进行的步骤：SS1：血管经预处理获得血管基质；血管基质经胰酶处理，获得脱细胞血管基质；SS2：使用胶原蛋白溶液孵育所述脱细胞血管基质，获得预处理后脱细胞血管基质；然后将EDC、NHS、工程化外泌体和预处理后脱...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾文，闫娟，肖浩然，李彦召，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学，
类型：发明
国别省市：