一种肠癌专用的类器官培养基、培养方法和传代方法技术

本发明专利技术公开了一种肠癌专用的类器官培养基、应用和培养方法、传代方法，旨在培养基中加入新型肠生长因子促进类器官生长。本发明专利技术提供的肠癌类器官培养基其成分含有高血糖素样肽

【技术实现步骤摘要】
一种肠癌专用的类器官培养基、培养方法和传代方法


[0001]本专利技术涉及类器官培养
，具体涉及一种肠癌专用的类器官培养基、培养方法和传代方法。

技术介绍

[0002]肠癌是我国的十大恶性肿瘤之一，发病率约24/100000，也是近二三十年来发病率上升最快的肿瘤之一。肠癌包括结肠癌和直肠癌，肠癌的发病率从高到低依次为直肠、乙状结肠、盲肠、升结肠、降结肠及横结肠，近年有向近端(右半结肠)发展的趋势。肠癌早期无症状，或症状不明显，仅感不适、消化不良、大便潜血等。随着癌肿发展，症状逐渐出现，表现为大便习惯改变、腹痛、便血、腹部包块、肠梗阻等，伴或不伴贫血、发热和消瘦等全身症状。近年来，欧美肠癌发病率和死亡率出现下降，我国却出现增长趋势。数据显示，我国肠癌患者的5年生存率为52.7％，显著低于欧美和日韩等国。这主要因为我国肠癌的早诊早治率远落后于国外，约60％～70％的患者确诊时已是中晚期。目前，肠癌的治疗仍旧以手术为主，同时辅以放疗及化疗等以巩固治疗效果。虽然近年来业界在肠癌靶向治疗、免疫治疗等综合治疗方面取得了长足的进展，但总体预后并不乐观。
[0003]肠癌的病因尚未完全清楚，目前认为主要是环境因素与遗传因素综合作用的结果。肠癌的发生发展机制错综复杂，建立一套科学严谨的研究模型不但有利于肠癌的基础研究，而且有助于肠癌的诊断与治疗，有助于提高肠癌的生存率。类器官是衍生于干细胞或前体细胞的器官特异性细胞集合。体外培养的类器官在细胞成分和组织架构上与对应器官高度相似，并具备相应的功能学特征。与常规细跑培养在二维环境中培养单一细胞类群不同，类器官培养是在三维环境中培养出特定组织器官包含的多种细胞类群，其培养体系与体内微环境更为相似。因此，在各种器官生理病理的基础研究、精准医疗、药物筛选和开发、基因治疗、再生医学等方面，显示出巨大的应用前景。
[0004]由于类器官是多能干细胞或器官祖细胞分化，自组装成有结构和功能的三维组织结构。形成各种类器官往往需要培养基、基质、生长因子和小分子化合物等等组分，且不同种了器官所需要的组分不尽相同，虽然多种肿瘤组织使用不同的方法、不同的培养条件下可在体外成功培养为类器官，但是目前关于肠癌类器官的培养方法的研究及报道较少，尤其是具体的试验流程、操作步骤、培养条件、即培养基配方尚无太多报道。

技术实现思路

[0005]由于肠为与外界环境密切接触器官，切除后的肠组织在制备成为类器官后培养1～2天常出现污染现象。未污染类器官在培养过程中也常出现活性不佳生长消极现象，针对上述问题，本专利技术的目的在于提供一种肠癌专用的类器官培养基、应用和培养方法、传代方法，旨在培养基中加入新型肠生长因子促进类器官生长，并通过改进实验方法降低污染率。
[0006]第一方面，本专利技术提供一种肠癌专用的类器官培养基。具体技术方案如下：
[0007]一种肠癌专用的类器官培养基，包含基础培养基Advanced DMEM/F12与以下浓度
的组分：
[0008]Rho蛋白酶抑制剂，2.5～5μM/mL；
[0009]两性霉素B，0.5～2μg/mL；
[0010]Primocin，50～200μg/mL；
[0011]胃泌素，2.5～10nM/mL；
[0012]A8301抑制剂，125～200nM/mL；
[0013]霍乱毒素，2.5～5ng/mL；
[0014]胰岛素样生长因子
‑
1，45ng/mL；
[0015]烟酰胺，4～8mM/mL；
[0016]胰岛素，1～2μg/mL；
[0017]胎牛血清，5％于培养基；
[0018]高血糖素样肽
‑
2，10
‑
100ng/ml；
[0019]非必需氨基酸，25～400μM/mL；
[0020]以及选自B
‑
27添加剂和N
‑
2添加剂中的至少一种的添加剂，与培养基体积比值1:25～1:50。
[0021]上述特异性添加因子各组分的浓度均以其在基础培养基和无菌水的混合液中的浓度为准。
[0022]Rho蛋白酶抑制剂：一种激酶抑制剂。
[0023]两性霉素：由结节链霉菌产生的七烯大环内酯类抗生素，有抑制或杀灭真菌的作用。
[0024]Primocin：用于保护原代细胞免受微生物污染的抗生素，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、支原体和真菌均有杀伤作用。
[0025]胃泌素：G细胞分泌的一种能促进胃肠细胞生长的激素。
[0026]A83
‑
01：一种激酶抑制剂。
[0027]霍乱毒素：催化G蛋白的α亚基失去GTP酶活性，导致对AC(腺苷酸环化酶)的持续激活。
[0028]胰岛素样生长因子
‑
1：一组具有促生长作用的多肽类物质，能够促进细胞生长。
[0029]烟酰胺：组织培养基的营养成分。
[0030]胰岛素：由胰脏内的胰岛β细胞分泌的一种激素，具有促进组织细胞对葡萄糖的摄取和利用的作用。
[0031]胎牛血清：组织培养基的营养成分。
[0032]高血糖素样肽
‑
2：是高血糖素原基因在肠道组织中的特异表达翻译后处理加工产物，作用于肠癌组织的G蛋白偶联受体超家族成员，转导促肠上皮细胞增殖信号，促进肠癌类器官增殖，提高类器官抗凋亡能力。
[0033]B
‑
27添加剂：是一款成分确定的无血清添加剂，包含抗氧化剂、蛋白、维生素和脂肪酸，这些组分以最优比例混合后可支持神经细胞的培养。
[0034]N
‑
2添加剂：是一种化学成分确定的无血清添加剂。推荐用于支持源自外周神经系统和中枢神经系统的原代神经母细胞瘤及有丝分裂后神经元的生长和表达。
[0035]进一步地，所述的非必需氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨
酸、脯氨酸和丝氨酸中的一种或多种。
[0036]第二方面，本专利技术提供一种前述培养基在培养肠癌类器官中的应用。
[0037]第三方面，本专利技术提供一种采用前述培养基培养人原肠癌类器官的培养方法，包括以下步骤：
[0038](一)将肠癌组织提前预冷，用含有1
‑
2％抗生素的DPBS溶液清洗后剪碎；
[0039](二)使用含有由胶原酶IV 400U/ml、Dnase I 200U/ml、透明质酸酶200
‑
400U/ml、Advanced DMEM/F12配制而成的消化液25ml进行37℃水浴震荡分次消化；
[0040]胶原酶IV：胶原酶、梭菌蛋白酶混合而成的酶，具有胰蛋白酶和蛋白水解活性，能在生理PH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织，用来从组织中提取目标细胞。
[0041]Dnase I：是一种脱氧核糖核酸内切酶，可将单链或双链DNA同等程度进行本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肠癌专用的类器官培养基，其特征在于，包含基础培养基Advanced DMEM/F12与以下浓度的组分：Rho蛋白酶抑制剂，2.5～5μM/mL；两性霉素B，0.5～2μg/mL；Primocin，50～200μg/mL；胃泌素，2.5～10nM/mL；A8301抑制剂，125～200nM/mL；霍乱毒素，2.5～5ng/mL；胰岛素样生长因子
‑
1，45ng/mL；烟酰胺，4～8mM/mL；胰岛素，1～2μg/mL；胎牛血清，5％于培养基；高血糖素样肽
‑
2，10
‑
100ng/ml；非必需氨基酸，25～400μM/mL；以及选自B
‑
27添加剂和N
‑
2添加剂中的至少一种的添加剂，与培养基体积比值1:25～1:50。2.根据权利要求1所述的一种肠癌专用的类器官培养基，其特征在于，所述的非必需氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸中的一种或多种。3.一种如权利要求1所述的培养基在培养肠组织及肠癌类器官中的应用。4.一种采用权利要求1所述的培养基培养肠癌类器官的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(一)将肠癌组织提前预冷，用含有1
‑
2％抗生素的DPBS溶液清洗后剪碎；(二)使用含有由胶原酶IV 400U/ml、Dnase I 200U/ml、透明质酸酶200
‑
400U/ml、Advanced DMEM/F12配制而成的消化液25ml进行37℃水浴震荡分次消化...

【专利技术属性】
技术研发人员：苗春光，王倩，殷岐，郁嘉懿，洪冰心，
申请(专利权)人：安徽骆华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：