本发明专利技术属于生物技术和医学领域，具体涉及小鼠树突状细胞外泌体作为肝癌疫苗的制备方式。本发明专利技术的目的是这样实现的：一种小鼠树突状细胞外泌体疫苗，所述外泌体疫苗是提取小鼠树突状细胞来源的外泌体，负载鼠源性肝癌特异性抗原优势表位肽以及免疫佐剂得到。性抗原优势表位肽以及免疫佐剂得到。性抗原优势表位肽以及免疫佐剂得到。
【技术实现步骤摘要】
一种小鼠树突状细胞外泌体介导的肝癌疫苗的制备
[0001]本专利技术属于生物技术和医学领域，具体涉及小鼠树突状细胞外泌体作为肝癌疫苗的制备方式。
技术介绍
[0002]肝癌，因其恶性程度高，进展迅速，已成为全球癌症死亡第二大原因，我国第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因。肝恶性肿瘤仍然是一个全球性的健康威胁，2025年预计发病人数将超过一百万例。由于肝癌多重耐药机制、复杂的生理屏障和免疫微环境等导致肝癌的临床治疗效果很不理想。肝癌的发生、发展、转移和复发与机体的免疫系统有密切的关系。免疫治疗通过增强机体免疫功能可激活抗肿瘤免疫应答，从而抑制肿瘤进展、复发和转移，已成为肿瘤临床研究的热点。肝癌疫苗通过抗原可激活抗肿瘤免疫应答，有效地抑制肿瘤复发和转移，包括细胞疫苗、肽疫苗、DC疫苗、DNA疫苗等，一般肝癌疫苗因肝细胞癌患者有长期慢性肝病背景，病人免疫功能处于抑制状态，不足以引起有效的免疫应答。然而，临床上的治疗方法也并未取得理想效果。
[0003]树突状细胞(DC)由于其强大的抗原提呈作用，被用于负载肿瘤抗原，制备细胞性疫苗，被证实能有效地诱导抗原特异性免疫应答，如最早被批准上市的针对前列腺癌的DC疫苗。但是，体外培养增殖后的DC细胞回输后存在机体排异现象且操作繁琐，耗时昂贵，并且肿瘤相关抗原(TAA)特异性T细胞对肿瘤细胞的亲和力较低，抗肿瘤免疫应答能力有限。
[0004]这一系列问题严重限制DC临床疫苗的发展和应用。对此开发了外泌体疫苗，其可以一定程度上将佐剂和多表位抗原共传递到淋巴器官和抗原提呈细胞中，通过外泌体疫苗可以微调疫苗的细胞内释放和抗原的交叉表达。树突状细胞分泌的外泌体(DEX)被证明携带有绝大部分的DC细胞表面分子尤其是与免疫激活相关的组织相容性复合体(MHC
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I和MHC
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II)和协同刺激因子CD80、CD86、CD54等，由于具备这些特点，DEX被认为是一种可以用来代替树突状细胞而激活免疫反应的非细胞生物纳米疫苗。负载特异性抗原肽的DEX疫苗是新兴的免疫治疗策略之一。DEX疫苗作为非细胞疫苗，其组成明确，结构稳定，安全性高，可长期冷冻保存，可按照GMP批量生产，克服了DC细胞疫苗的诸多缺点，在肿瘤免疫治疗方面更有优越性。但其存在的副作用以及制备方法的复杂性，使其在制备和应用方面令人担忧。
技术实现思路
[0005]基于此，本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种树突状细胞外泌体作为肝癌疫苗。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案包括如下几个方面：
[0007]本专利技术的目的是这样实现的：一种树突状细胞外泌体疫苗，所述外泌体疫苗是提取小鼠树突状细胞来源的外泌体，负载肝癌特异性抗原优势表位肽以及免疫佐剂得到。
[0008]为此，本专利技术提供一种树突状细胞外泌体疫苗，其包括小鼠树突状细胞来源的外
泌体，肝癌特异性抗原以及免疫佐剂。
[0009]其中，所述肝癌特异性抗原选自：AFP 212短肽、其氨基酸序列为：GSMLNEHVM，为SEQ ID NO.1；GPC3 127
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136短肽，其氨基酸序列为：AMFKNNYPSL，为SEQ ID NO.2。
[0010]其中，所述免疫佐剂选自：N1ND，其氨基酸序列为：
[0011]MPKRKVSSAEGAAKEEPKRRSARLSAKPPAKVEAKPKKAAAKDKSSDKKVQT，为SEQ ID NO.3。
[0012]本专利技术的另一个目的在于提供树突状细胞外泌体肝癌疫苗的制备，包括以下步骤：
[0013](1)收集小鼠骨髓树突状细胞外泌体(DEX)上清液：先提取小鼠骨髓树突状细胞前体单核细胞，培养于6孔板中，加入1640完全培养基，待诱导其分化成熟为树突状细胞，收集树突状细胞的上清液；
[0014](2)提取小鼠树突状细胞(DC)外泌体：将收集的树突状细胞的上清液先500g，5min离心，去除大细胞团，保留上清液；随后，将上清液依次离心。先2000g，10min离心，将上清液取出，再10000g，离心30min，去除大囊泡和碎片；最后将上清液转至超速离心管中，110000g，离心70min，得到外泌体沉淀。然后加入大量PBS，再次110000g，离心70min，弃上清，用200ulPBS重悬外泌体；
[0015](3)制备小鼠树突状细胞外泌体疫苗：将上步获取的外泌体与小鼠肝癌抗原肽AFP 212、GPC3 127
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136和免疫佐剂N1ND，放置冰箱共孵育12
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48h，即得。
[0016]最优选的，树突状细胞外泌体肝癌疫苗的制备，包括以下步骤：
[0017](1)收集小鼠骨髓树突状细胞外泌体(DEX)上清液：先提取小鼠骨髓树突状细胞前体单核细胞，培养于6孔板中，加入10％1640完全培养基，每孔2ml，待诱导其分化成熟为树突状细胞，隔天换液收集树突状细胞上清液；
[0018](2)提取小鼠树突状细胞(DC)外泌体：将收集的树突状细胞的上清液先500g，5min离心，去除大细胞团，保留上清液；随后，将上清液依次离心。先2000g，10min离心，将上清液取出，再10000g，离心30min，去除大囊泡和碎片；最后将上清液转至超速离心管中，110000g，离心70min，得到外泌体沉淀。然后加入大量PBS，再次110000g，离心70min，弃上清，用200ulPBS重悬外泌体。所有步骤都在4℃下进行；
[0019](3)制备小鼠树突状细胞外泌体疫苗：用200ulPBS重悬外泌体，反复吹打后转至1.5mlEP管中，BCA定量外泌体的浓度50ug/ml。根据生产制造商说明配制多肽。浓度均为1mg/ml。加入鼠源性肝癌抗原肽AFP 212：GSMLNEHVM、GPC3 127
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136:AMFKNNYPSL和免疫佐剂N1ND各10ul，放置4℃冰箱孵育24h。
[0020]步骤(1)中，10％1640完全培养基：10％1640完全培养基是指加入了10％胎牛血清(FBS)以及90％1640不完全培养基配置而成的完全培养基。
[0021]步骤(2)中，2000g，10min离心：2000g，10min离心是指2000g离心力，离心10分钟。
[0022]其中，PBS：磷酸缓冲盐溶液的简称，是一种缓冲液，也可用作洗涤液
[0023]步骤(3)中BCA定量外泌体：是指用BCA蛋白定量方法检测外泌体蛋白浓度，是一种用作外泌体定量检测的方法
[0024]其中，多肽是指抗原肽AFP 212、GPC3 127
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136、免疫佐剂N1ND。
[0025]本专利技术另一个目的在于提供小鼠树突状细胞外泌体疫苗在制备治疗癌症中的应用。
[0026]所述癌症为肝癌。
[0027]综上所述，本专利技术的有益效果为：
[0028]本专利技术提供一种由小鼠肝癌特异性抗原AF本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种小鼠树突状细胞外泌体疫苗，其特征在于，包括小鼠树突状细胞来源的外泌体，鼠源性肝癌特异性抗原以及免疫佐剂，其中，所述鼠源性肝癌特异性抗原选自：AFP 212短肽，氨基酸序列为：SEQ ID NO.1所示；GPC3 127
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136短肽，氨基酸序列为：SEQ ID NO.2所示；免疫佐剂选自：N1ND，氨基酸序列：SEQ ID NO.3所示。2.一种小鼠树突状细胞外泌体肝癌疫苗的制备方法，其特征在于，(1)收集小鼠骨髓树突状细胞外泌体上清液：先提取小鼠骨髓树突状细胞前体单核细胞，培养于6孔板中，加入1640完全培养基，待诱导其分化成熟为树突状细胞，收集树突状细胞的上清液；(2)提取小鼠树突状细胞外泌体：将收集的树突状细胞的上清液离心，去除大细胞团，弃上清，加入PBS重悬外泌体；(3)制备小鼠树突状细胞外泌体疫苗：将上步获取的外泌体与小鼠肝癌抗原肽AFP 212、GPC3 127
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136和免疫佐剂N1ND，放置冰箱共孵育12
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48h，即得。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)加入5
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20％的1640完全培养基。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)将收集的树突状细胞的上清液先500g，5min离心，去除大细胞团，保留上清液；随后，2000g，10min离心，将上清液取出，10000g，离心30min，去除大囊泡和碎片；最后将上清液转至超速离心管中，110000g，离心70min，得到外泌体沉淀。加入大量PBS，再次110000g，离心70min，弃上清，然后加入200ulPBS重悬外泌体。5.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：李伟华，肖俐，蔡超，邢恩鸿，李传云，罗淑敏，徐芳，陈静，
申请(专利权)人：北京肝病研究所，
类型：发明
国别省市：
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