CSZ培养基及基于测序指导的鲸杆菌的分离与培养方法技术

本发明专利技术公开了一种CSZ培养基及基于测序指导的鲸杆菌的分离与培养方法，涉及微生物技术领域。每1L所述CSZ培养基的原料按重量份计算，包括：胨8

【技术实现步骤摘要】
CSZ培养基及基于测序指导的鲸杆菌的分离与培养方法


[0001]本专利技术涉及微生物
，具体涉及一种CSZ培养基及基于测序指导的鲸杆菌的分离与培养方法。

技术介绍

[0002]随着全球人口的增加，水产养殖在渔业中的地位越来越重要。近年来，我国的水产养殖业向着高密度集约化方向迅速发展，在取得高产量的同时也带来了一系列的问题，如养殖动物的抗病力下降、脂肪蓄积，肉质变差等。已有的研究表明，通过补充益生菌可以有效缓解水产养殖中的水产动物抗病力下降、脂肪蓄积等问题。
[0003]水产动物的肠道微生物组成与畜禽动物有很大差异，如何从水产动物肠道中高效快速的分离益生菌对于开发水产用益生菌资源具有重要意义。
[0004]索氏鲸杆菌(Cetobacterium somerae)是一种水产养殖动物肠道中的核心细菌，有研究表明鲸杆菌不仅可以通过刺激食欲来促进鱼类生长，其发酵产物也可以显著提高鱼类对病原菌的抵抗力，降低脂肪蓄积并提高机体的抗氧化能力，因此鲸杆菌可以作为一种潜在的水产益生菌。但由于鲸杆菌是一种厌氧细菌，分离培养难度大，目前未见有关于鲸杆菌的分离培养方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供的一种CSZ培养基及基于测序指导的鲸杆菌的分离与培养方法，旨在解决上述
技术介绍
中存在的问题。
[0006]为了实现上述技术目的，本专利技术主要采用如下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术公开了一种用于鲸杆菌培养的CSZ培养基，每1L所述CSZ培养基的原料按重量份计算，包括：胨8
‑
12g，大豆蛋白胨2
‑
4g，酵母浸粉4
‑
6g，牛肉粉2
‑
2.5g，消化血清粉10
‑
15g，牛肝浸粉1
‑
1.5g，糖源6
‑
10g，磷酸二氢钾2
‑
3g，氯化钠2
‑
4g，L
‑
半胱氨酸0.1
‑
0.5g，硫乙醇酸钠0.1
‑
0.5g；pH 7.0～9.0。
[0008]在本专利技术的较佳实施方式中，所述糖源选自葡萄糖、果糖、水苏糖、蜜二糖、蔗糖或甘露糖中的一种或几种。
[0009]进一步的，每1L所述CSZ培养基的原料按重量份计算，包括：胨10g，大豆蛋白胨3g，酵母浸粉5g，牛肉粉2.2g，消化血清粉13.5g，牛肝浸粉1.2g，甘露糖8g，磷酸二氢钾2.5g，氯化钠3g，L
‑
半胱氨酸0.3g，硫乙醇酸钠0.3g；pH 8.5。
[0010]第二方面，本专利技术公开了一种基于测序指导的鲸杆菌的分离与培养方法，包括如下步骤：
[0011](1)鲸杆菌的体内富集：将以豆粕为主要蛋白源的饲料饲喂给水产养殖动物，两周后收集肠道内容物，进行16S rRNA测序，获得鲸杆菌在水产养殖动物肠道内的丰度；
[0012](2)富集培养基的制备：配制如权利要求1
‑
3中任一项所述的CSZ培养基，此时，CSZ培养基为CSZ液体培养基，然后，在无氧条件下灭菌，得到富集培养基；
[0013](3)鲸杆菌的体外富集：收集步骤(1)中的水产养殖动物的肠道内容物，用生理盐水重悬，将重悬液转移至步骤(2)中灭完菌后的富集培养基中，合适的温度下静置培养，得到含有鲸杆菌的菌液；
[0014](4)鲸杆菌的体外分离与培养：将步骤(3)中的菌液涂布于CSZ固体培养基，厌氧条件下进行培养，挑选固体培养基上的单一菌落，重悬于CSZ液体培养基中，然后吸取混有单菌落的液体，转移至步骤(2)中的富集培养基中，在合适的温度下静置培养。
[0015]在本专利技术的较佳实施方式中，步骤(2)中，在无氧条件下进行灭菌的方法为：将配制的CSZ液体培养基转移至玻璃厌氧管，氮吹后迅速盖上管塞，灭菌。
[0016]进一步的，氮吹时的氮气流速为20～60ml/min，吹气时间为2～10min，优选的，氮吹时的氮气流速为40ml/min，吹气时间为5min。
[0017]进一步的，步骤(3)中，在25～37℃条件下静置培养；优选的，在28℃条件下静置培养。
[0018]进一步的，步骤(4)中，CSZ固体培养基为CSZ液体培养基添加质量分数为1.5％的琼脂制成。
[0019]进一步的，本专利技术公开的一种基于测序指导的鲸杆菌的分离与培养方法，还包括：
[0020](5)鲸杆菌的鉴定：取步骤(4)经过培养后的菌液，提取基因组，使用引物27F和1492R扩增细菌16S rRNA基因，PCR产物进行测序，将获得的序列在NCBI网站上进行比对，并使用MEGA11软件构建系统进化树，确定目标菌种。
[0021]优选的，所述鲸杆菌为索氏鲸杆菌ZNN
‑
1，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，引物27F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，引物1492R的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0022]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0023]本专利技术提供的基于测序指导的鲸杆菌的分离与培养方法，首次创新的提出了通过饲料来富集动物体内鲸杆菌的丰度以降低分离难度，此外本专利技术无需在厌氧培养箱内进行厌氧培养，极大的降低了鲸杆菌的培养难度。本专利技术的方法在国内外尚未见报道。
附图说明
[0024]图1为本专利技术步骤(1)的结果，具体为饲喂罗非鱼以豆粕饲料(SM)和鱼粉饲料(FM)两周，罗非鱼肠道内索氏鲸杆菌(Cetobacterium somerae)的相对丰度水平。
[0025]图2为本专利技术步骤(2)中所述的液体培养基的除氧装置效果图；其中，1氮气瓶，2硅胶软管，3气体流量计，4氮吹仪气针，5玻璃厌氧管；
[0026]图3为本专利技术步骤(4)中的菌液涂布于CSZ固体培养基培养12小时后的结果。菌落形态为大小2
‑
6mm,规则圆形、边缘光滑、不透明、微隆起的菌落。
[0027]图4为索氏鲸杆菌ZNN
‑
1基于16S rRNA基因序列的NJ系统发育树；
[0028]图5为相比于含质量分数为2％鱼粉的CSZ培养基中培养8小时的索氏鲸杆菌ZNN
‑
1，含质量分数为2％豆粕的CSZ培养基中培养8小时的索氏鲸杆菌ZNN
‑
1被显著上调基因的KEGG富集分析图；
[0029]图6为索氏鲸杆菌ZNN
‑
1在含不同浓度糖源的CSZ培养基中培养12小时后的浓度；
[0030]图7为索氏鲸杆菌ZNN
‑
1在不同pH培养基中的生长曲线。
具体实施方式
[0031]结合以下具体实施例和附图，对本专利技术作进一步的详细说明。实施本专利技术的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本专利技术没有特别限制内容。
[0032]下面结合实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于鲸杆菌培养的CSZ培养基，其特征在于，每1L所述CSZ培养基的原料按重量份计算，包括：胨8
‑
12g，大豆蛋白胨2
‑
4g，酵母浸粉4
‑
6g，牛肉粉2
‑
2.5g，消化血清粉10
‑
15g，牛肝浸粉1
‑
1.5g，糖源6
‑
10g，磷酸二氢钾2
‑
3g，氯化钠2
‑
4g，L
‑
半胱氨酸0.1
‑
0.5g，硫乙醇酸钠0.1
‑
0.5g；pH 7.0
‑
9.0。2.根据权利要求1所述的用于鲸杆菌培养的CSZ培养基，其特征在于，所述糖源选自葡萄糖、果糖、水苏糖、蜜二糖、蔗糖或甘露糖中的一种或几种。3.根据权利要求2所述的用于鲸杆菌培养的CSZ培养基，其特征在于，每1L所述CSZ培养基的原料按重量份计算，包括：胨10g，大豆蛋白胨3g，酵母浸粉5g，牛肉粉2.2g，消化血清粉13.5g，牛肝浸粉1.2g，甘露糖8g，磷酸二氢钾2.5g，氯化钠3g，L
‑
半胱氨酸0.3g，硫乙醇酸钠0.3g；pH 8.5。4.一种基于测序指导的鲸杆菌的分离与培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)鲸杆菌的体内富集：将以豆粕为主要蛋白源的饲料饲喂给水产养殖动物，两周后收集肠道内容物，进行16S rRNA测序，获得鲸杆菌在水产养殖动物肠道内的丰度；(2)富集培养基的制备：配制如权利要求1
‑
3中任一项所述的CSZ培养基，此时，CSZ培养基为CSZ液体培养基，然后，在无氧条件下灭菌，得到富...

【专利技术属性】
技术研发人员：张美玲，周楠楠，杜震宇，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：