来那度胺在尿液中的代谢物及应用制造技术

本发明专利技术建立了一种同时测定人尿中11种来那度胺代谢物的快速灵敏的分析方法；对代谢物进行了质谱鉴定；从而为分析来那度胺在体内的代谢情况、机体的病理和生理情况提供了可能性；比较了缓解期(EG)、症状无变化(SG)，症状恶化(IG)多发性骨髓瘤患者之间代谢物的差异，从代谢物分析的角度，研究利用尿中代谢物鉴别来那度胺耐药，同时为早期快速筛选出来那度胺耐药患者提供了可能性，避免患者症状恶化及不必要的治疗。要的治疗。

【技术实现步骤摘要】
来那度胺在尿液中的代谢物及应用


[0001]本专利技术属生物医药
，具体涉及人尿液中来那度胺代谢物的分析方法、质谱鉴定及作为诊断标志物在制备鉴别多发性骨髓瘤患者来那度胺耐药的产品中的应用。

技术介绍

[0002]来那度胺，被批准用于治疗各种癌症包括多发性骨髓瘤(MM)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、边缘区淋巴瘤(MZL)等。多发性骨髓瘤(MM)是血液系统的第二大常见恶性肿瘤，约占血液系统恶性肿瘤的10％。我国MM发病率为1.6/10万且呈逐年增高状态，发病年龄有年轻化趋势。
[0003]来那度胺主要在肾脏消除，约90％通过尿液消除，尿中代谢物是药物与机体作用的最终结果反映，可以直接准确地反映药物在体内的代谢情况、机体的病理和生理情况，更重要的是尿液获取方便、简单、无创、快速、易行，尿液代谢物已成为一种理想的评估药物在体内的代谢情况及临床筛查和早期诊断手段。
[0004]成都中医药大学罗莉娅等开发了UPLC－MS/MS法研究来那度胺在小鼠体内的组织分布[1]。Muzaffar Iqbal等开发了串联质谱法测定兔和人血浆中来那度胺[2]，但都是利用动物或人的血浆和组织检测，检测的是来那度胺，没有对人尿中来那度胺代谢物进行检测和鉴定。
[0005]来那度胺治疗的患者中，少数患者病情恶化，而其他患者病情保持稳定或好转。因此，如果能在症状恶化前及时筛选出耐药患者，及时对此类患者采取其他治疗方案，就能避免症状恶化及昂贵且不必要的治疗。
[0006]NgYLD等报道了，收集5例患者治疗前和复发时的骨髓样本，进行基于串联质谱标记技术(TMT)的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析和RNA测序，确定了CDK6是在治疗难治复发多发性骨髓瘤中的主要调控因子[3]，但由于采用的是骨髓样本，取样有创、不易行。同济大学附属第十人民医院血液科报道了：CRBN的基因突变能导致来那度胺耐药[4]，但鉴定需要进行基因检测，检测昂贵且复杂。
[0007]特拉维夫大学萨克勒医学院的Yael C.Cohen等报道采用患者血液或骨髓进行单细胞测序鉴定复发性多发性骨髓瘤患者耐药途径及治疗靶点[5]，但采用患者血液或骨髓，取样有创，操作复杂，而且目前仅限于少数实验室能做单细胞基因组分析。
[0008]现有技术文献
[0009][1]罗莉娅,邓星,苟立平,等.UPLC
‑
MS/MS法研究来那度胺在小鼠体内的组织分布[J].中国临床药理学杂志,2019,35(14):5.
[0010][2]Iqbal M,Wani T A,Nasr Y Khalil
…
Developmentand validation of ultra
‑
performance liquid chromatographic method with tandem mass spectrometry for determination of lenalidomide in rabbit and human plasma[J].Chemistry Central Journal,2013,7(1):7.
[0011][3]李新,郭彩虹,黄仲夏.来那度胺在多发性骨髓瘤治疗中的应用[J].临床药物
治疗杂志,2013.
[0012][4]胡柯,陶怡,施菊妹.多发性骨髓瘤的精准医疗:耐药机制与相关生物学标志物的探索[J].上海医学,2021,44(6):5.
[0013][5]Zada,M.,Wang,S.Y.,Bornstein,C.,David,E.,Moshe,A.,Li,B.,...&Amit,I.Identification of resistance pathways and therapeutic targets in relapsed multiple myeloma patients through single
‑
cell sequencing.Nature Medicine.

技术实现思路

[0014]专利技术所要解决的问题：
[0015]本专利技术建立一种人尿中11种来那度胺代谢物的快速灵敏的分析方法；对代谢物进行了质谱鉴定；比较了缓解期(EG)、症状无变化(SG)，症状恶化(IG)多发性骨髓瘤患者之间代谢物的差异，从代谢物分析的角度，研究利用尿中代谢物鉴别来那度胺耐药。
[0016]本专利技术解决了尚无快速灵敏的尿中来那度胺代谢物的分析方法和尚没有对尿中来那度胺代谢物进行质谱鉴定问题，从而为分析来那度胺在体内的代谢情况、机体的病理和生理情况提供了可能性；解决了尚无尿中代谢物作为耐药标志物的问题，从而为早期快速筛选出来那度胺耐药患者提供了可能性，避免患者症状恶化及不必要的治疗。
[0017]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0018]本专利技术第一方面是提供一种人尿液中来那度胺代谢物的分析方法，包括如下步骤：
[0019](1)样本
[0020]以未经来那度胺治疗的膀胱癌患者尿液样本作为空白样本(BS)，以来那度胺治疗的膀胱癌患者尿液样本作为分析样本。分析样本被分为三组：来自缓解期患者(EG)、症状无变化的患者(SG)，以及其他来自症状恶化的患者(IG)。
[0021](2)供试品溶液和对照品溶液的配制
[0022]供试品溶液：每500～1000μL的尿液样本在冷冻干燥机中干燥，然后溶解在甲醇、乙腈和水的混合物(1：3：5)中1～5ml中。溶液在
‑
20～
‑
40℃下保存，并在分析前通过0.22μm过滤膜过滤。
[0023]对照品溶液：来那度胺精确称量，并溶解在甲醇中并稀释成每1ml中含0.1～10μg的溶液。
[0024](3)将供试品溶液和对照品溶液进行UPLC
‑
MS/MS分析
[0025]UPLC条件：柱温为40℃；流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为0.1％甲酸乙腈；进样量为2μl；流速为0.1～0.5mL/min；梯度洗脱，所述梯度洗脱条件如下：
[0026]0min 5％ B；5min 95％ B
[0027]质谱条件：大气压化学电离或电喷雾电离；质量分析器为线性或三维离子肼质谱、四级杆飞行时间质谱、静电场轨道离子肼质谱或三重四级杆质谱；正离子扫描模式采集一级质谱图和二级质谱图，采集范围m/z50
‑
2000，二级质谱碰撞能量为10
‑
70V。
[0028]进一步地，分析方法包括如下步骤：
[0029]供试品溶液：每600μL的尿液样本在冷冻干燥机中干燥，然后溶解在甲醇、乙腈和水的混合物(1:3:5)中2ml中。溶液在
‑
20℃下下保存，并在分析前通过0.22μm过滤膜过滤。
[0030]对照品溶液：来那度胺精确称量，并溶解在甲醇中并稀释成每1ml中含0.5μg的溶液。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人尿液中来那度胺代谢物的分析方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)供试品溶液和对照品溶液的配制：所述供试品溶液的配制方法：每500～1000μL的尿液样本在冷冻干燥机中干燥，然后溶解在甲醇、乙腈和水的混合物(1:3:5)中1～5ml中。溶液在
‑
20～
‑
40℃下保存，并在分析前通过0.22μm过滤膜过滤；所述对照品溶液的配制方法：来那度胺精确称量，并溶解在甲醇中并稀释成每1ml中含0.1～10μg的溶液；(2)将供试品溶液和对照品溶液进行UPLC
‑
MS/MS分析：UPLC条件为柱温为40℃；流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为0.1％甲酸乙腈；进样量为2μl；流速为0.1～0.5mL/min；梯度洗脱，所述梯度洗脱条件如下：0min 5％B；5min 95％B；质谱条件大气压化学电离或电喷雾电离；质量分析器为线性或三维离子肼质谱、四级杆飞行时间质谱、静电场轨道离子肼质谱或三重四级杆质谱；正离子扫描模式采集一级质谱图和二级质谱图，采集范围m/z50
‑
2000，二级质谱碰撞能量为10
‑
70V。2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：供试品溶液：每600μL的尿液样本在冷冻干燥机中干燥，然后溶解在甲醇、乙腈和水的混合物(1：3：5)中2ml中，溶液在
‑
20℃保存，并在分析前通过0.22μm过滤膜过滤；对照品溶液：来那度胺精确称量，溶解在甲醇中并稀释成每1ml中含0.5μg的溶液；UPLC条件为柱温为40℃；流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为0.1％甲酸乙腈；进样量为2μl；流速为0.35mL/min；梯度洗脱，所述梯度洗脱条件如下：0min 5％B；5min 95％B；质谱条件电喷雾电离；质量分析器为四级杆飞行时间质谱；正离子扫描模式采集一级质谱图和二级质谱图，采集范围m/z100
‑
1500，二级质谱碰撞能量为20
‑
60V。3.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述冻干的温度为
‑
50～
‑
80℃。4.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述冻干的温度为
‑
60～
‑
70℃。5.人尿液中来那度胺代谢物包括M1～M11，其特征在于，采用如权利要求1
‑
4任一项所述的分析方法鉴定得到。6.根据权利要求5所述的来那度胺代谢物M1，其特征在于，结构式如M1所示：所述来那度胺代谢物M1，[M+H]
+
离子的质荷比(m/z)为245.0926，分子式为C
13
H
12
N2O3，为C4
‑
脱氨来那度胺。7.根据权利要求5所述的来那度胺代谢物M2，其特征在于，结构式如M2所示：
所述来那度胺代谢物M2，[M+H]
+
离子的质荷比(m/z)为245.0926，分子式为C
13
H
12
N2O3，为C1
′‑
脱氨来那度胺。8.根据权利要求5所述的来那度胺代谢物M3，其特征在于，结构式如M3所示：所述来那度胺代谢物M3，[M+H]
+
...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹晓凯，张永波，张森，张建颖，张建伟，刘侃，陈怡东，
申请(专利权)人：詹晓凯，
类型：发明
国别省市：