一种荧光增敏型荧光探针的制备及在半胱氨酸和同型半胱氨酸检测中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种用于特异性检测半胱氨酸（Cys）和同型半胱氨酸（Hcy）的增敏型荧光探针。本发明专利技术通过在AIE活性分子TPE上键合不同数量NBD基团成功合成“开启型”荧光探针TPE

【技术实现步骤摘要】
一种荧光增敏型荧光探针的制备及在半胱氨酸和同型半胱氨酸检测中的应用


[0001]本专利技术涉及一种荧光增敏型荧光探针的制备及在半胱氨酸和同型半胱氨酸检测中的应用，属于化学合成领域和氨基酸检测


技术介绍

[0002]通常来说，含有巯基的化合物被称为硫醇，其中生物硫醇是一类对维持生命至关重要的物质，部分原因是因为生物体系中存在一种化学平衡，这种平衡与生物体系中的氧化还原过程是密切相关的。小分子生物硫醇包括半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH），它们是体内生物硫醇中含量最多的小分子，在人体复杂的生理过程和病理过程中具有不可替代的作用。例如，GSH和乙酰辅酶A的前体是Cys，在蛋白质结构和功能中起着重要作用。它还可以在生理条件下发生可逆的氧化还原反应，在维持蛋白质的三级和四级结构中扮演着至关重要的角色。所以细胞内硫醇含量的异常波动会导致许多疾病，通常情况下，半胱氨酸水平的异常会导致神经毒性、毛发褪色、水肿以及皮肤损害等疾病。血浆中同型半胱氨酸水平的失衡是心血管等疾病的重要诱发因素。此外，血浆中半胱氨酸的总浓度也与出生缺陷以及老年人的认知障碍等一些疾病密切相关。而GSH作为细胞内一种内源抗氧化剂，可参与维持细胞内的氧化还原活性、新陈代谢以及细胞内信号转导等过程。更确切地说，人体内GSH的失衡是许多疾病引发的直接信号，包括癌症、心血管疾病以及阿尔茨海默病症等。因此，设计开发能够实时监测生物硫醇水平波动的检测方法具有重要意义和迫切需求。
[0003]鉴于生物硫醇在生物学、临床和环境方面的重要性，目前研究者对用于检测硫醇的测试分析方法表现出越来越浓厚的兴趣。迄今为止，已经报道了一些被用来检测和测定生物硫醇的分析方法，如电化学法、高效液相色谱（HPLC）、毛细管电泳法、质谱仪（MS）和高效液相
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质谱仪/质谱仪等。然而，上述方法均具有一定局限性，如所需仪器设备价格昂贵、操作复杂、检测时间过长、灵敏度不高等。而与上述方法相比，荧光法因其具有无创、响应时间短、灵敏度高、成本低、操作简便和肉眼可见等优点，受到了研究者的广泛关注。在过去的十年里，已经开发了大量用于检测生物硫醇的荧光探针。这些探针可以选择性地检测半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽中的一种或两种。其中，基于四苯乙烯（TPE）分子出色的AIE发光特性、易功能化修饰、灵敏的荧光响应特征，越来越多的TPE衍生物被开发出来，成功用于生物分子的检测。虽然基于TPE的AIE荧光探针已经取得了令人瞩目的研究成果，但是目前，大部分报道仅限于合成某种功能性TPE衍生物，然后重点围绕其对生物分子的检测应用开展研究，而较少探究TPE衍生物上响应基团的取代位置和数量对其应用效果的影响情况及变化规律。我们认为，此方面的研究将有助于为新型TPE基AIE荧光探针材料的开发提供更有效的设计思路和方法。
[0004]鉴于此，本专利技术设计合成了基于荧光增敏型的Cys和Hcy特异性荧光探针：TPE
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NBD，TPE
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2NBD，TPE
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4NBD。该探针分别以不同数量的硝基苯并呋喃（NBD）基团修饰TPE，建立
取代基团数量不同的荧光增强型Cys和Hcy识别体系，系统研究取代基团数量对AIE发光性能和生物硫醇检测效果方面的影响，从而探索一种可对半胱氨酸和同型半胱氨酸进行高效检测的AIE荧光探针体系。研究结果表明，与一取代TPE
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NBD和二取代TPE
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2NBD探针相比，四取代TPE
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4NBD荧光探针不仅对Cys和Hcy表现出更好的选择性和灵敏度，而且具有最低的检出限。由此可知，基于TPE衍生物的生物分子荧光探针的荧光响应性和检测灵敏度将随着TPE分子上取代基数量的增加而显著提高。因此，本研究证明，在设计合成AIE型生物分子荧光探针时，通过增加AIE小分子上活性取代基的数量，可提高AIE型生物分子荧光探针的检测灵敏度和降低检出限。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种荧光增敏型荧光探针的制备方法；本专利技术的另一目的是提供荧光增敏型荧光探针在在半胱氨酸和同型半胱氨酸检测中的应用。
[0006]一、荧光增敏型荧光探针的制备在无水DMF中依次加入羟基化四苯乙烯、4
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氯
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硝基苯并呋喃、三乙胺，室温条件下搅拌反应1.5~2.5 h，然后将混合溶液加入冰水中产生沉淀，将其进行过滤，滤饼用无水甲醇洗涤，得到淡黄色固体，真空干燥后得产物。羟基化四苯乙烯与4
‑
氯
‑7‑
硝基苯并呋喃的摩尔比为1:1~1:2。
[0007]所述羟基化四苯乙烯为TPE
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OH、TPE
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2OH或TPE
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4OH；其中TPE
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OH的结构式为：；TPE
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2OH的结构式为：；TPE
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4OH的结构式为：。
[0008]合成路线为： 二、荧光增敏型荧光探针的结构及溶剂效应
1、探针TPE
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NBD、TPE
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2NBD、TPE
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4NBD的微观形貌表征通过SEM测试探究Cys加入前后TPE
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NBD、TPE
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2NBD和TPE
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4NBD荧光探针的微观形貌变化情况。由图10（a，b）可以观察到，单取代的TPE
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NBD为棒状结构，而当加入Cys之后TPE
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NBD的棒状结构被破坏，呈现出多孔状无规聚集结构。同样，如图10（c，d）所示，二取代的探针TPE
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2NBD在与Cys作用之前也显示出棒状结构，而在加入Cys之后TPE
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2NBD的棒状结构被破坏，也呈现出多孔状无规聚集结构。除此之外，如图10（e，f）所示，四取代的探针TPE
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4NBD在与Cys作用前后形貌也发生了明显变化。TPE
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4NBD为球形聚集结构，但在加入Cys之后，TPE
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4NBD变为多孔状无规聚集结构。上述测试结果表明，Cys与TPE
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NBD、TPE
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2NBD和TPE
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4NBD之间发生一定相互作用，改变了荧光探针的结构。
[0009]2、EDS能谱分析为了进一步分析TPE
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NBD、TPE
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2NBD和TPE
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4NBD荧光探针的元素组成及分布情况，我们采用EDS能谱对三种探针进行测试。图11分别为TPE
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NBD、TPE
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2NBD和TPE
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4NBD的EDS谱图。由图可知，三种探针分子上均含有C，N，O三种元素，且分布较为均匀。
[0010]除此之外，还进行了TPE
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种荧光增敏型荧光探针的制备方法，其特征在于：在无水DMF中依次加入羟基化四苯乙烯、4
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氯
‑7‑
硝基苯并呋喃、三乙胺，室温条件下搅拌反应1.5~2.5 h，然后将混合溶液加入冰水中产生沉淀，将其进行过滤，滤饼用无水甲醇洗涤，得到淡黄色固体，真空干燥后得产物；所述羟基化四苯乙烯为TPE
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OH、TPE
‑
2OH或TPE
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4OH；其中TPE
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OH的结构式为：，得到对应的产物TPE
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NBD的结构式为：；TPE
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2OH的结构式为：，得到对应的产物TPE
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2NBD的结构式为：；TPE
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4OH的结构式为：，得到对应的产物TPE
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4NBD的结构式为：。2.如权利要求1所述的一种荧光增敏型荧光探针的制备方法，其特征在于：羟基化四苯乙烯与4
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氯
‑7‑
硝基苯并呋喃的摩尔比为1:1~1:2。3.如权利要求1所述的方法制备的荧光增敏型荧光探针在检测半胱氨酸和同型半胱氨酸中的应用。4.如权利要求3所述的方法制备的荧光增敏型荧光探针在检测半胱氨酸和同型半胱氨酸中的应用，其特征在于：荧光探针选择性识别半胱氨酸和同型半胱氨酸，在荧光探针TPE
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NBD的THF溶液、TPE
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2NBD的ACN溶液或TPE
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4NBD的DMF溶液中分别加入谷氨酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、天冬氨酸、谷胱甘肽、酪氨酸、丙氨基酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、瓜氨酸、脯氨酸、丝氨酸、缬氨酸溶液，只有半胱氨酸和同型半胱氨酸能使探针溶液的荧光显著增强。5.如权利要求3所述的方法制备的荧光增敏型荧光探针在检测半胱氨酸和同型半胱氨
酸中的应用，其特征在于：荧光探针定量检测半胱氨酸和同型半胱氨酸，线性关系如下：定量检测半胱氨酸：在0.1
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0.8
×
10
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5 M浓度范围内，TPE...

【专利技术属性】
技术研发人员：关晓琳，韩阳，来守军，王康，张文涛，范玉雯，
申请(专利权)人：西北师范大学，
类型：发明
国别省市：