一种基于微生物发酵得栀子降尿酸代谢产物发酵浸膏的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种基于微生物发酵得栀子降尿酸代谢产物发酵浸膏的方法。该方法通过以下步骤实现：（1）复苏菌株后于灭菌后的MRS培养基中培养得种子液；（2）将栀子粉和蒸馏水混合后灭菌，然后将混合浆料接种种子液，接种后进行厌氧发酵，将发酵液过滤浓缩得栀子降尿酸代谢产物发酵浸膏。本发明专利技术利用微生物发酵转化技术和质谱分子网络，开展以抑制XOD酶活性为导向的天然产物发现研究，为天然来源治疗高尿酸血症药物先导化合物的发现探索新途径，对本学科的发展具有重要的科学价值和现实意义。价值和现实意义。价值和现实意义。

【技术实现步骤摘要】
一种基于微生物发酵得栀子降尿酸代谢产物发酵浸膏的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于微生物发酵得栀子降尿酸代谢产物发酵浸膏的方法。

技术介绍

[0002]高尿酸血症（Hyperuricemia）主要是由于人体嘌呤类物质代谢发生紊乱而引起的一种代谢类疾病，主要病理表现为体内尿酸生成增多或尿酸排泄明显减少而引起人体血清中尿酸浓度异常增高的现象。近年来，随着我国社会经济的发展，居民的饮食结构发生了较大改变，由于高嘌呤食物摄入过多，使得高尿酸血症发病率呈逐年上升趋势。流行病学调查显示，近10年我国高尿酸血症患病率为5.5%
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19.3%，痛风患病率为0.8%
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2.2%。高尿酸血症不仅发病率高，还可引起一系列的并发症。肾功能损伤是其常见的并发症，这是由于尿酸盐结晶在肾小管部位不断沉积而引发的肾脏组织炎症反应，表现为血液中尿酸、肌酐、尿素氮等指标的异常升高。此外，高尿酸血症患者还往往伴有冠心病、心血管疾病、糖尿病等，严重者甚至引起尿毒症、肾衰竭而导致死亡。高尿酸血症严重威胁人类健康，已成为不容忽视的全民健康问题。
[0003]基于对高尿酸血症发病机制的研究，目前临床上治疗高尿酸血症的主要策略为减少尿酸生成和促进尿酸排泄。黄嘌呤氧化酶（XOD）作为一种广泛表达于肝脏、肾脏等的羟化酶，为尿酸生成的限速酶，催化次黄嘌呤转化为黄嘌呤，再进一步氧化为尿酸。大量证据表明，抑制XOD活性进而减少尿酸生成是当前临床上控制高尿酸血症的一线治疗手段。
[0004]目前经FDA批准上市的黄嘌呤氧化酶抑制剂类药物包括别嘌醇和非布索坦，但是临床数据报告显示，长期服用别嘌醇容易引起皮肤不良反应、白细胞减少等血液系统疾病，严重时可引起继发性感染或内脏器官功能衰竭。非布索坦虽具有较好的治疗效果，但其易引起头痛、肝功能和肾功能损伤。高尿酸血症治疗药物多具有明显的副作用，临床使用并不理想。因此，研究开发新型低毒高效的治疗高尿酸血症药物具有重要的现实意义。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在的天然来源创新药物研发过程中效率低、针对性差等问题，本专利技术提供了一种基于微生物发酵得栀子降尿酸代谢产物的方法。
[0006]本专利技术为了实现上述目的所采用的技术方案为：本专利技术提供了一种基于微生物发酵得栀子降尿酸代谢产物发酵浸膏的方法，包括以下步骤：（1）复苏菌株后于灭菌后的MRS培养基中培养得种子液；（2）将栀子粉和蒸馏水混合后灭菌，然后将混合浆料接种种子液，接种后进行厌氧发酵，将发酵液过滤浓缩得栀子降尿酸代谢产物发酵浸膏。
[0007]本专利技术发酵过程中，所使用的菌株为植物乳杆菌（LPLC）、嗜酸乳杆菌（LACC）和长双岐杆菌（BLOC）；所述培养为37 ℃培养1 d。
[0008]进一步的，步骤（2）中，所述栀子粉和蒸馏水的比例为6 g:80 mL；所述灭菌为在121 ℃下，灭菌25 min；所述种子液接种的浓度为108CFU/mL；所述厌氧发酵为37 ℃厌氧培养3 d。
[0009]本专利技术通过发酵得到的栀子降尿酸代谢产物发酵浸膏中，栀子降尿酸代谢产物的分离方法为：将发酵液过滤浓缩得栀子降尿酸代谢产物发酵浸膏，将发酵浸膏分散在10倍体积的水中，经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位四个组分，经过XOD酶活性导向，对乙酸乙酯部位通过正反硅胶柱色谱和HPLC半制备柱分离纯化，得栀子降尿酸代谢产物。
[0010]上述栀子降尿酸代谢产物的具体分离纯化过程为：（a）将乙酸乙酯部位通过200
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300目的硅胶柱分离，并用CH2Cl2/MeOH逐步洗脱产生六个组分Fr1
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Fr6；（b）Fr2通过200
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300目硅胶柱经石油醚/乙酸乙酯洗脱和SephadexLH
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20分离后，再用半制备型HPLC制备得到芹菜素（apigenin）、木犀草素（luteolin）、异鼠李素（isorhamnetin）和甲基麦冬黄酮A（methylophiopogonone A）；（c）Fr3通过200
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300目硅胶柱经石油醚/乙酸乙酯洗脱和SephadexLH
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20分离后，由半制备型HPLC制备得到吐叶醇（blumenol A）和阿魏酸（ferulic acid）；（d）Fr4通过200
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300目硅胶柱经石油醚/乙酸乙酯洗脱和SephadexLH
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20后，由半制备型HPLC制备得到南烛木树脂酚（lyoniresinol）和柳叶柴胡酚（salicifoliol）。
[0011]进一步的，步骤（a）中，所述CH2Cl2/MeOH逐步洗脱的比例为20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:5、0:1。
[0012]进一步的，步骤（b）中，所述石油醚/乙酸乙酯的洗脱比例为2:1；所述SephadexLH
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20为MeOH/CH2Cl2= 1/1；所述半制备型HPLC的参数为：MeOH/H2O = 60/40，2.0mL/min。
[0013]进一步的，步骤（c）中，所述石油醚/乙酸乙酯的洗脱比例为3:2；所述SephadexLH
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20为MeOH/CH2Cl2= 1/1；所述半制备型HPLC的参数为：MeOH/H2O = 50/50，2.0mL/min。
[0014]进一步的，步骤（d）中，所述石油醚/乙酸乙酯的洗脱比例为1:1；所述SephadexLH
‑
20为MeOH/CH2Cl2= 1/1；所述半制备型HPLC的参数为：MeOH/H2O = 40/60，2.0mL/min。
[0015]本专利技术通过发酵后分离纯化得到的栀子苷尿酸代谢产物为：。
[0016]本专利技术通过微生物发酵对栀子粉进行转化，通过微生物细胞将复杂的底物进行结构修饰和改造，以微生物为载体，利用其代谢过程中产生的酶对外源化合物进行的水解、氧
化还原、脱水、缩合、羟基化等催化反应，具有较高的区域和立体选择性更易得到结构新颖的化合物，为新药开发提供更有价值的先导化合物。
[0017]本专利技术的有益效果为：（1）本专利技术通过肠道微生物发酵栀子，发酵之后的栀子浸膏对XOD酶活性的抑制作用显著增强（提高了4.2倍），生成了黄酮类、环烯醚萜类、生物碱类等差异代谢物；对发酵前后栀子的浸膏进行UPLC
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QTOF
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HRMS实验，对数据结果进行代谢组学分析，结果显示发酵组较未发酵组（GFE）的化学成分出现了较显著的差异，以长双岐杆菌（BLOC）发酵组/GFE组为例，一是化学成分的相对含量发生了变化，如栀子苷发生水解反应生成了入血苷元京尼平（含量增加了33.89倍）；二是新产生了栀子中原来没有的化合物，如原有化学成分发生氧化、酯化等反应新产生了harpagide、eugenol acetate、isorhapontige本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于微生物发酵得栀子降尿酸代谢产物发酵浸膏的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）复苏菌株后于灭菌后的MRS培养基中培养得种子液；（2）将栀子粉和蒸馏水混合后灭菌，然后将混合浆料接种种子液，接种后进行厌氧发酵，将发酵液过滤浓缩得栀子降尿酸代谢产物发酵浸膏。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述菌株为植物乳杆菌（LPLC）、嗜酸乳杆菌（LACC）和长双岐杆菌（BLOC）；所述培养为37 ℃培养1 d。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述栀子粉和蒸馏水的比例为6g:80mL；所述灭菌为在121 ℃下，灭菌25 min；所述种子液接种的浓度为10
8 CFU/mL；所述厌氧发酵为37 ℃厌氧培养3 d。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述栀子降尿酸代谢产物发酵浸膏中，栀子降尿酸代谢产物的分离方法为：将发酵液过滤浓缩得栀子降尿酸代谢产物发酵浸膏，将发酵浸膏分散在10倍体积的水中，经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位四个组分，经过XOD酶活性导向，对乙酸乙酯部位通过正反硅胶柱色谱和HPLC半制备柱分离纯化，得栀子降尿酸代谢产物。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述栀子降尿酸代谢产物的具体分离纯化过程为：（a）将乙酸乙酯部位通过200
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300目的硅胶柱分离，并用CH2Cl2/MeOH逐步洗脱产生六个组分Fr1
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Fr6；（b）Fr2通过200
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300目硅胶柱经石油醚/乙酸乙酯洗脱和SephadexLH
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20分离后，再用半制备型HPLC制备得到芹菜素（apigenin）、木犀草素（luteolin）、异鼠李素（isorhamnetin）和甲基麦冬黄酮A（methylophiopogonone A）；（c）Fr...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘超，张梦启，孙金月，郭溆，陈莹莹，孙书涛，任麒东，
申请(专利权)人：山东省农业科学院，
类型：发明
国别省市：