一种甲砜霉素半抗原、人工抗原、抗体及其制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种甲砜霉素半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用。所述甲砜霉素半抗原结构式如式(I)所示，基于该半抗原制备人工抗原免疫动物得到单克隆抗体；基于该抗体制备甲砜霉素胶体金免疫层析试纸条，对甲砜霉素的IC

【技术实现步骤摘要】
一种甲砜霉素半抗原、人工抗原、抗体及其制备和应用


[0001]本专利技术涉及食品安全检测
，更具体地，涉及一种甲砜霉素半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]甲砜霉素(Thiamphenicol，TAP)是第二代氯霉素类广谱抗菌药物，属于酰胺醇类抗生素，作为代替氯霉素的抗菌药物，甲砜霉素克服了氯霉素的潜在致命副作用，如骨髓抑制、再生障碍性贫血、灰婴综合征等，在动物养殖中常用于治疗和预防细菌感染，促进动物生长。但甲砜霉素仍具有较强的血液毒性、胚胎毒性以及免疫毒性，可抑制体内免疫球蛋白合成和抗体的生成，损害人体免疫功能。我国GB 31650
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2019《食品中兽药最大残留限量的国家标准》甲砜霉素属于限用药物且禁止在产蛋期使用。
[0003]为了保障环境安全和人类生命健康，建立快速高效的甲砜霉素检测方法亟待解决。
[0004]目前，甲砜霉素的检测方法主要为仪器分析方法，包括：气相色谱、液相色谱串联质谱法、色谱
‑
质谱联用法以及表面增强拉曼光谱技术等。此类方法仪器昂贵，操作繁琐，限制了其在现场中高通量筛查的使用。免疫分析方法具有低成本、高通量的优点，与大型仪器确证方法优势互补，逐渐成为检测兽药残留的主流技术。对于免疫分析法而言，抗体作为核心原材料，抗体的效果很大程度是取决于引起相应动物发生免疫反应的抗原结构。只有合成、制备出合适的甲砜霉素半抗原，才能够获得特异性强、灵敏度高的抗体。虽然中国专利CN 111592476 A已经公开了一种甲砜霉素半抗原及甲砜霉素人工抗原，并通过动物免疫获得了单克隆抗体，并采用化学发光酶联免疫方法，测定抗体的IC
50
值为0.26ng/mL，最低检测限为0.1ng/mL，但该半抗原通过三步制备得到，且检测全程约50min，不适用于现场的高通量快速检测。同时，现有用于甲砜霉素检测的人工抗原、抗体数量较少，因此需要提供更多可用于甲砜霉素免疫检测的半抗原、抗原和应用抗体的快速检测方法，对能够快速、灵敏、高通量的检测甲砜霉素具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种甲砜霉素半抗原。
[0006]本专利技术的第二个目的在于提供所述甲砜霉素半抗原的制备方法。
[0007]本专利技术的第三个目的是提供所述甲砜霉素半抗原的应用。
[0008]本专利技术的第四个目的在于提供一种甲砜霉素人工抗原。
[0009]本专利技术的第五个目的在于提供所述甲砜霉素人工抗原的应用。
[0010]本专利技术的第六个目的在于提供一种甲砜霉素抗体。
[0011]本专利技术的第七个目的在于提供所述甲砜霉素抗体的应用。
[0012]本专利技术的第八个目的在于提供一种检测甲砜霉素的快速免疫分析方法及胶体金
免疫层析试纸条。
[0013]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
[0014]一种甲砜霉素半抗原，其结构式如式(I)所示：
[0015][0016]本专利技术甲砜霉素半抗原在甲砜霉素分子基础上引入极性基团并延长间隔臂，通过氢氧化钾水解甲砜霉素的酰胺键生成氨基，然后再与丁二酸酐进行酰胺缩合反应，引入4个碳的间隔臂以及羧基，从而得到所设计的半抗原。
[0017]本专利技术所述甲砜霉素半抗原的制备方法，包括以下步骤：
[0018]S1.将甲砜霉素与氢氧化钾加入有机溶液中，加热进行回流反应，除去有机溶剂后得到产物I；
[0019]S2.将产物I溶于N,N
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二甲基甲酰胺(DMF)中，加入丁二酸酐进行搅拌反应，反应结束后，分离，除去有机溶剂后得到白色粉末状产物II，即甲砜霉素半抗原。
[0020][0021]优选地，步骤S1中，所述有机溶剂为含50％甲醇的水溶液。
[0022]优选地，步骤S1中，所述甲砜霉素与氢氧化钾的摩尔比为1:1～1.2。
[0023]优选地，步骤S1中，所述反应条件为70～90℃反应1
‑
2h。
[0024]优选地，步骤S2中，所述甲砜霉素与丁二酸酐的摩尔比为1:1.1～1.5。
[0025]优选地，步骤S2中，所述反应条件为20～25℃，反应12
‑
24h。
[0026]优选地，步骤S2中，所述分离为采用200～300目硅胶柱层析分离(乙酸乙酯:石油醚＝1:1)
[0027]优选地，步骤S1和S2中，为采用旋蒸法除去有机溶剂。
[0028]作为一种优选的可实施方案，所述甲砜霉素半抗原制备方法，具体包括如下步骤：称取甲砜霉素(710mg，2mmol)，氢氧化钾(112mg，2mmol)溶于6mL甲醇/水(1:1)混合溶液中，在80℃条件下反应2h。反应结束后用乙酸乙酯(50mL
×
3)萃取，合并有机相，蒸干溶剂后得到淡黄色粉末，即产物Ⅰ。将产物Ⅰ(245mg，1mmol)、丁二酸酐(120mg，1.2mmol)溶于2mL N,N
‑
二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下搅拌反应24h。反应结束后用乙酸乙酯(50mL
×
3)萃取，合并有机相，蒸干溶剂后，经200
‑
300目硅胶柱层析分离(乙酸乙酯:石油醚＝1:1)分离得到白色粉末状产物，即制得所述甲砜霉素半抗原。
[0029]本专利技术还提供式(I)所述甲砜霉素半抗原在制备甲砜霉素人工抗原中的应用。
[0030]一种甲砜霉素人工抗原，由式(I)所述甲砜霉素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述甲砜霉素人工抗原结构式如式(II)所示：
[0031][0032]优选地，载体蛋白为乳铁蛋白(LF)或鸡卵清白蛋白(OVA)，LF用于制备免疫原，OVA用于制备包被原。
[0033]优选地，所述偶联的方式为活泼酯法。
[0034]作为一种优选地可实施方式，所述甲砜霉素人工抗原的制备方法，包括如下步骤：将甲砜霉素半抗原5mg与10mg EDC、5mg NHS溶于200μL的DMF中，4℃下搅拌过夜，离心后取上清为A液。称取载体蛋白10mg，将溶解于2mL的包被缓冲溶液中，为B液。磁力搅拌下，吸取A液逐滴缓慢加入到B液中，4℃下搅拌反应12h。离心后取上清液，装入透析袋中，4℃下用PBS(0.01M，pH7.4)透析3天，每天换3次透析液，得到人工抗原，于
‑
20℃保存备用。
[0035]本专利技术还提供一种甲砜霉素抗体，是以式(II)所述甲砜霉素人工抗原为免疫原制备得到。所述抗体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、纳米抗体等。
[0036]优选地，所述抗体为甲砜霉素单克隆抗体，是以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)的甲砜霉素人工抗原为免疫原；选取适龄雌性Balb/C小鼠进行免疫，第4次免疫和第5次免疫后测定抗血淸的效价和抑制率，在细胞融合前3天冲击免疫；取冲击免疫后的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，扩本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种甲砜霉素半抗原，其特征在于，其结构式如式(I)所示：2.权利要求1所述半抗原的制备方法，其特征在于，先将甲砜霉素在碱性条件下进行水解反应衍生出氨基，再与丁二酸酐发生酰胺缩合反应得到白色粉末状产物，即为式(I)所示甲砜霉素半抗原。3.权利要求1所述甲砜霉素半抗原在制备甲砜霉素人工抗原中的应用。4.一种甲砜霉素人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述甲砜霉素半抗原偶联载体蛋白得到，其结构式如式(II)所示：5.根据权利要求4所述甲砜霉素人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白为乳铁蛋白或鸡卵清白蛋白。6.根据权利要求4所述甲砜霉素人工抗原，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈玉栋，周文玥，杨金易，张咏仪，王弘，徐振林，孙远明，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：