ADSC-Exo工程化修饰后提升抗M2小胶质细胞铁死亡的方法及应用技术

本发明专利技术涉及ADSC

【技术实现步骤摘要】
ADSC
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Exo工程化修饰后提升抗M2小胶质细胞铁死亡的方法及应用


[0001]本专利技术涉及ADSC
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Exo领域，具体涉及ADSC
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Exo工程化修饰后提升抗M2小胶质细胞铁死亡的方法及应用。

技术介绍

[0002]ADSC
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Exo是指脂肪间充质干细胞外泌体。外泌体是一种细胞分泌物，可以通过细胞外液体传递信息和分子，对细胞间通讯和调节起到重要作用。脂肪间充质干细胞外泌体是从脂肪干细胞中分离出来的一种外泌体，具有多种生物学功能，如促进细胞增殖、抗炎、抗氧化等。这些功能使得脂肪间充质干细胞外泌体在医学研究和治疗方面具有广泛的应用前景。
[0003]小胶质细胞在卒中后不同阶段呈现不同的功能状态，使其具有神经损伤或神经保护双重作用。促炎型M1小胶质细胞在卒中后短期内持续增加，而抑炎型M2小胶质细胞在卒中后短暂增加，之后迅速下降。因此，通过调控抑炎型M2小胶质细胞数量，抑制免疫炎性微环境，是减少缺血再灌注损伤（Cerebral ischemia
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reperfusion injury，I/R）的关键。已有研究表明，ADSC（脂肪间充质干细胞）能下调脂多糖(LPS)刺激引起的BV2小胶质细胞中炎性细胞因子的分泌，可能是因为ADSC抑制了BV2 M1表型并促进了M2表型极化；也有研究表明，ADSC
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Exo可通过miRNA抑制小胶质细胞M1极化，促进M2表型极化，改善小鼠I/R。目前的研究大多集中在如何抑制促炎型M1小胶质细胞极化或促进抑炎型M2极化。但是，小胶质细胞表型的极化是一个复杂的过程，对极化方向的调控具有一定的挑战。
[0004]外泌体在缺血性脑卒中（Ischemic stroke，IS）治疗中展现了巨大潜力，但在动物实验中已证实其靶向能力是低效的。因此，通过工程技术修饰外泌体以增强其靶向能力变得十分有必要。在脑部疾病的研究中，与静脉注射相比，鼻腔给药可以更有效地将外泌体运输到大脑。但是，经鼻给予ADSC
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Exo也同样会被不同细胞内化，同时研究表明ADSC
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Exo的有效干预剂量在神经元和M2小胶质细胞之间存在差异，M2小胶质细胞对ADSC
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Exo的需求量更大。
[0005]因此，有鉴于此，本专利技术提供ADSC
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Exo工程化修饰后提升抗M2小胶质细胞铁死亡的方法及应用。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供ADSC
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Exo工程化修饰后提升抗M2小胶质细胞铁死亡的方法及应用。
[0007]为了解决上述技术问题，采用如下技术方案：ADSC
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Exo工程化修饰后提升抗M2小胶质细胞铁死亡的方法，包括以下步骤：（a）首先构建Lamp2b
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M2pep重组质粒，并将重组的所述质粒转染进ADSC中，得M2pep
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ADSC，然后将所述M2pep
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ADSC通过Western blot检测Lamp2b表达，并通过超速离心
法收集所述M2pep
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ADSC分泌的外泌体M2pep
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ADSC
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Exo；（b）先将取若干只小鼠随机分为Sham组、ADSC
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Exo组，M2pep
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ADSC
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Exo组，流式检测M2型小胶质细胞比例；（c）另外取若干只小鼠随机分为Sham组、PBS组、ADSC
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Exo组，ADSC
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Exo+M2pep
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ADSC
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Exo组，先通过mNSS评分神经缺损严重程度，然后通过GSH/GSSG检测谷胱甘肽水平。
[0008]进一步，在步骤（2）中，所述ADSC
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Exo组和M2pep
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ADSC
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Exo组的小鼠进行大脑中动脉梗塞手术，所述Sham组的小鼠进行相同的手术，不阻塞大脑中动脉。
[0009]进一步，在步骤（2）中，所述ADSC
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Exo组的小鼠在大脑中动脉梗塞手术后1至3 d后，每天通过经鼻给予的方式接受10 μg ADSC
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Exo，所述M2pep
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ADSC
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Exo组的小鼠在MCAO大脑中动脉梗塞手术后通过上述ADSC
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Exo组的小鼠相同的方法接受相同体积的M2pep
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ADSC
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Exo。
[0010]进一步，在步骤（3）中，所述PBS组、ADSC
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Exo组，ADSC
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Exo+M2pep
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ADSC
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Exo组的小鼠进行大脑中动脉梗塞手术，所述Sham组的小鼠进行相同的手术，不阻塞大脑中动脉。
[0011]进一步，在步骤（3）中，所述ADSC
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Exo组的小鼠在大脑中动脉梗塞手术后1至3 d后，每天通过经鼻给予的方式接受10μg ADSC
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Exo，所述ADSC
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Exo+M2pep
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ADSC
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Exo组的小鼠在MCAO大脑中动脉梗塞手术后通过上述ADSC
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Exo组的小鼠相同的方法，每天通过经鼻给予的方式接受5μg ADSC
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Ex和5μg M2pep
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ADSC
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Exo，所述PBS组的小鼠在大脑中动脉梗塞手术后通过上述ADSC
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Exo组的小鼠相同的方法接受相同体积的PBS 缓冲液3天。
[0012]进一步，所述ADSC
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Exo组每天通过经鼻给予的方式接受10μg ADSC
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Exo的方式如下：先取小鼠取仰卧位，在自主呼吸条件下采用异氟烷气体麻醉，对于ADSC
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Exo组的小鼠，每2min用微量移液枪将含有2μg ADSC
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Exo的2μL PBS滴入鼻腔，每次只滴入一侧鼻腔，两侧鼻腔交替进行，总计10 min完成10μg ADSC
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Exo的给予。
[0013]进一步，在步骤（2）和步骤（3）中，进行实验的小鼠均需要进行小鼠脑组织分离，具体过程如下：在大脑中动脉梗塞手术后3d腹腔注射1%戊巴比妥钠将小鼠麻醉，生理盐水心脏灌注后，取出皮层脑组织。
[0014]进一步，在步骤（3）中，通过GSH/GSSG检测谷胱甘肽水平的过程如下：（1）脑组织样品的准备：每10 mg组织加100 μL蛋白去除试剂M溶液，匀浆离心取上清；（2）细胞样品的准备：加入细胞沉淀体积3倍量的蛋白去除试剂M溶液。液氮和37℃水浴2次冻融，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. ADSC
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Exo工程化修饰后提升抗M2小胶质细胞铁死亡的方法，其特征在于包括以下步骤：（a）首先构建Lamp2b
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M2pep重组质粒，并将重组的所述质粒转染进ADSC中，得M2pep
‑
ADSC，然后将所述M2pep
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ADSC通过Western blot检测Lamp2b表达，并通过超速离心法收集所述M2pep
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ADSC分泌的外泌体M2pep
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ADSC
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Exo；（b）先将取若干只小鼠随机分为Sham组、ADSC
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Exo组，M2pep
‑
ADSC
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Exo组，流式检测M2型小胶质细胞比例；（c）另外取若干只小鼠随机分为Sham组、PBS组、ADSC
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Exo组，ADSC
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Exo+M2pep
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ADSC
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Exo组，先通过mNSS评分神经缺损严重程度，然后通过GSH/GSSG检测谷胱甘肽水平。2.根据权利要求1所述的ADSC
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Exo工程化修饰后提升抗M2小胶质细胞铁死亡的方法，其特征在于：在步骤（2）中，所述ADSC
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Exo组和M2pep
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ADSC
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Exo组的小鼠进行大脑中动脉梗塞手术，所述Sham组的小鼠进行相同的手术，不阻塞大脑中动脉。3.根据权利要求2所述的ADSC
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Exo工程化修饰后提升抗M2小胶质细胞铁死亡的方法，其特征在于：在步骤（2）中，所述ADSC
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Exo组的小鼠在大脑中动脉梗塞手术后1至3 d后，每天通过经鼻给予的方式接受10 μg ADSC
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Exo，所述M2pep
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ADSC
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Exo组的小鼠在MCAO大脑中动脉梗塞手术后通过上述ADSC
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Exo组的小鼠相同的方法接受相同体积的M2pep
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ADSC
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Exo。4.根据权利要求1所述的ADSC
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Exo工程化修饰后提升抗M2小胶质细胞铁死亡的方法，其特征在于：在步骤（3）中，所述PBS组、ADSC
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Exo组，ADSC
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Exo+M2pep
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ADSC
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Exo组的小鼠进行大脑中动脉梗塞手术，所述Sham组的小鼠进行相同的手术，不阻塞大脑中动脉。5.根据权利要求4所述的ADSC
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Exo工程化修饰后提升抗M2小胶质细胞铁死亡的方法，其特征在于：在步骤（3）中，所述ADSC
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Exo组的小鼠在大脑中动脉梗塞手术后1至3 d后，每天通过经鼻给予的方式接受10 μg ADSC
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Exo，所述ADSC
‑
Exo+M2pep
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ADSC...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵静，汪勇，刘卓航，初敏，张增雨，
申请(专利权)人：上海市闵行区中心医院，
类型：发明
国别省市：