ADSC-Exo通过Fxr2Atf3Slc7a11轴抑制M2型小胶质细胞铁死亡的方法及应用技术

本发明专利技术涉及ADSC

【技术实现步骤摘要】
ADSC
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Exo通过Fxr2Atf3Slc7a11轴抑制M2型小胶质细胞铁死亡的方法及应用


[0001]本专利技术涉及ADSC
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Exo领域，具体涉及ADSC
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Exo通过Fxr2Atf3Slc7a11轴抑制M2型小胶质细胞铁死亡的方法及应用。

技术介绍

[0002]作为中枢神经系统的第一道免疫防线，小胶质细胞在缺血性脑卒中（Ischemic stroke，IS）中扮演着重要角色。脑缺血发生后几分钟，小胶质细胞即活化并释放相应的细胞因子、趋化因子、Ca2+等来调节自身的表型和功能。小胶质细胞通过活化为M1/M2表型来调控炎症反应，维持免疫炎性微环境稳态，抵御缺血、清除凋亡和受损细胞、重塑不适当的神经连接从而帮助神经系统恢复稳态。经典激活的M1型小胶质细胞主要分泌促炎因子，启动炎症反应，引起细胞凋亡及继发损伤。选择性激活的M2型小胶质细胞又分为M2a、M2b、M2c和Mox等多种亚型，可分泌大量神经保护营养因子，在抑制氧化应激、炎症修复、血管生成、髓鞘形成、以及神经元再生方面起重要作用。
[0003]小胶质细胞在卒中后不同阶段呈现不同的功能状态，使其具有神经损伤或神经保护双重作用。促炎型M1小胶质细胞在卒中后短期内持续增加，而抑炎型M2小胶质细胞在卒中后短暂增加，之后迅速下降。因此，通过调控抑炎型M2小胶质细胞数量，抑制免疫炎性微环境，是减少缺血再灌注损伤（Cerebral ischemia
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reperfusion injury，I/R）的关键。已有研究表明，ADSC（脂肪间充质干细胞）能下调脂多糖(LPS)刺激引起的BV2小胶质细胞中炎性细胞因子的分泌，可能是因为ADSC抑制了BV2 M1表型并促进了M2表型极化；也有研究表明，ADSC
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Exo可通过miRNA抑制小胶质细胞M1极化，促进M2表型极化，改善小鼠I/R。目前的研究大多集中在如何抑制促炎型M1小胶质细胞极化或促进抑炎型M2极化。但是，小胶质细胞表型的极化是一个复杂的过程，对极化方向的调控具有一定的挑战。
[0004]鉴于脑卒中急性期存在M2型小胶质细胞迅速下降的现象，那么急性期保护现有M2型小胶质细胞，减缓M2型小胶质细胞比例的下降，进而抑制炎症微环境促进神经元存活可能是一个重要的保护手段。已有研究表明，M1型巨噬细胞和小胶质细胞对铁死亡不敏感，而M2型巨噬细胞和小胶质细胞对铁死亡高度敏感。这种敏感性差异若在IS里也存在，那么卒中早期M2型小胶质细胞的迅速下降可能与铁死亡有关。
[0005]有鉴于此，本专利技术提供一种ADSC
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Exo通过Fxr2Atf3Slc7a11轴抑制M2型小胶质细胞铁死亡的方法及应用。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供ADSC
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Exo通过Fxr2Atf3Slc7a11轴抑制M2型小胶质细胞铁死亡的方法及应用。
[0007]为了解决上述技术问题，采用如下技术方案：ADSC
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Exo通过Fxr2Atf3Slc7a11轴抑制M2型小胶质细胞铁死亡的方法，包括以下
步骤：（1）先取若干只实验小鼠分成Sham组和MCAO组，然后通过磁珠分选出在Sham组和MCAO组的小鼠梗死侧脑组织中的小胶质细胞，并进行了二代测序实验得到Atf3是Sham组和MCAO组间差异倍数最大的铁死亡相关基因Atf3，确定ADSC
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Exo内含物中调控M2型小胶质细胞铁死亡关键基因的RNA结合蛋白，并通过放线菌素D实验和RIP实验验证调控关系。
[0008]（2）将所述小胶质细胞诱导成M2型小胶质细胞，并将M2型小胶质细胞后分为CON组和OGD/R组，OGD/R组根据干预措施不同分为PBS组、外泌体L929
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Exo对照组和ADSC
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Exo组，进行RT
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qPCR实验得到M2型小胶质细胞中Atf3表达显著增高。
[0009]（3）构建Fxr2过表达BV2细胞稳转株，通过Western blot、CCK
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8、MDA、以及GSH/GSSG实验确定ADSC
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Exo通过Fxr2/Atf3/Slc7a11轴对M2型小胶质细胞铁死亡的调控作用。
[0010]进一步，另外取若干只实验小鼠分成Sham组和MCAO组，MCAO组的小鼠根据干预措施不同分为PBS组、外泌体L929
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Exo对照组和ADSC
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Exo组，在小鼠大脑中动脉梗塞手术后3d取脑组织进行磁珠分选小胶质细胞，进行RT
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qPCR实验得到小胶质细胞中Atf3表达显著增高。
[0011]进一步，所述MCAO组的小鼠在大脑中动脉梗塞手术后1至3d后，每天接受10μgADSC
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Exo干预，具体方式如下：先取小鼠取仰卧位，在自主呼吸条件下采用异氟烷气体麻醉，对于所述MCAO组的小鼠，每2 min用微量移液枪将含有2 μg ADSC
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Exo的2 μL PBS滴入鼻腔，每次只滴入一侧鼻腔，两侧鼻腔交替进行，总计10 min完成10 μg ADSC
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Exo的给予。
[0012]进一步，通过磁珠分选出小胶质细胞的过程如下：（1）用90 μL预冷PBS缓冲液重悬分离出来的脑细胞，加入10μLCD11b磁珠，混匀后4℃避光孵育15min；（2）加入1mL预冷PB缓冲液清洗，300g，4℃离心5 min；（3）500μL预冷PB缓冲液重悬细胞；（4）用3mL预冷PB缓冲液润洗分选柱；（5）将分选柱安装至分选器后加入样本，待样本从分选柱全部流出加入3mL预冷PB缓冲液，待缓冲液从分选柱全部流出再加入3 mL预冷PB缓冲液，共加3次；（6）将分选柱从分选器中取出，加入5 mL预冷PB缓冲液后快速按压分选柱底部推柱，50mL离心管收集滤液，重复4
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6次；（7）400g，4℃离心5 min，弃上清留细胞备用。
[0013]进一步，所述二代测序实验使用illumina Novaseq
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6000进行双端测序，测序模式为PE150。
[0014]进一步，通过所述放线菌素D实验的过程如下：（1）将原代小胶质细胞以3x105/孔接种于6孔板中，在37℃、5% CO2条件下，用含10%FBS和1%青/链霉素的F12培养基培养；（2）24h后诱导成M2型小胶质细胞；（3）24h后加入PBS或ADSC
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Exo, 同时加入5 μM 转录抑制剂放线菌素D；（4）分别在加入放线菌素D后0 h、3 h、和6 h收集各组细胞提取RNA；（5）RT
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qPCR检测目标基因mRNA水平。
[0015]进一步，所述RIP实验采用RIP实验使用PureBinding
®
RNA Immunopreci本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. ADSC
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Exo通过Fxr2Atf3Slc7a11轴抑制M2型小胶质细胞铁死亡的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）先取若干只实验小鼠分成Sham组和MCAO组，然后通过磁珠分选出在Sham组和MCAO组的小鼠梗死侧脑组织中的小胶质细胞，并进行了二代测序实验得到Atf3是Sham组和MCAO组间差异倍数最大的铁死亡相关基因Atf3，确定ADSC
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Exo内含物中调控M2型小胶质细胞铁死亡关键基因的RNA结合蛋白，并通过放线菌素D实验和RIP实验验证调控关系；（2）将所述小胶质细胞诱导成M2型小胶质细胞，并将M2型小胶质细胞后分为CON组和OGD/R组，OGD/R组根据干预措施不同分为PBS组、外泌体L929
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Exo对照组和ADSC
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Exo组，进行RT
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qPCR实验得到M2型小胶质细胞中Atf3表达显著增高；（3）构建Fxr2过表达BV2细胞稳转株，通过Western blot、CCK
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8、MDA、以及GSH/GSSG实验确定ADSC
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Exo通过Fxr2/Atf3/Slc7a11轴对M2型小胶质细胞铁死亡的调控作用。2.根据权利要求1所述的ADSC
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Exo通过Fxr2Atf3Slc7a11轴抑制M2型小胶质细胞铁死亡的方法，其特征在于：另外取若干只实验小鼠分成Sham组和MCAO组，MCAO组的小鼠根据干预措施不同分为PBS组、外泌体L929
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Exo对照组和ADSC
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Exo组，在小鼠大脑中动脉梗塞手术后3d取脑组织进行磁珠分选小胶质细胞，进行RT
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qPCR实验得到小胶质细胞中Atf3表达显著增高。3.根据权利要求1所述的ADSC
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Exo通过Fxr2Atf3Slc7a11轴抑制M2型小胶质细胞铁死亡的方法，其特征在于：所述MCAO组的小鼠在大脑中动脉梗塞手术后1至3d后，每天接受10μgADSC
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Exo干预，具体方式如下：先取小鼠取仰卧位，在自主呼吸条件下采用异氟烷气体麻醉，对于所述MCAO组的小鼠，每2 min用微量移液枪将含有2 μg ADSC
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Exo的2 μL PBS滴入鼻腔，每次只滴入一侧鼻腔，两侧鼻腔交替进行，总计10 min完成10 μg ADSC
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Exo的给予。4.根据权利要求1所述的ADSC
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Exo通过Fxr2Atf3Slc7a11轴抑制M2型小胶质细胞铁死亡的方法，其特征在于：通过磁珠分选出小胶质细胞的过程如下：（1）用90 μL预冷PBS缓冲液重悬分离出来的脑细胞，加入10μLCD11b磁珠，混匀后4℃避光孵育15min；（2）加入1mL预冷PB缓冲液清洗，300g，4℃离心5 min；（3）500μL预冷PB缓冲液重悬细胞；（4）用3mL预冷PB缓冲液润洗分选柱；（5）将分选柱安装至分选器后加入样本，待样本从分选柱全部流出加入3mL预冷PB缓冲液，待缓冲液从分选柱全部流出再加入3 mL预冷PB缓冲液，共加3次；（6）将分选柱从分选器中取出，加入5 mL预冷PB缓冲液后快速按压分选柱底部推柱，50mL离心管收集滤液，重复4
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6次；（7）400g，4℃离心5 min，弃上清留细胞备用。5.根据权利要求1所述的ADSC
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Exo通过Fxr2Atf3Slc7a11轴抑制M2型小胶质细胞铁死亡的方法，其特征在于：所述二代测序实验使用illumina Novaseq
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6000进行双...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵静，汪勇，张增雨，刘卓航，初敏，
申请(专利权)人：上海市闵行区中心医院，
类型：发明
国别省市：