基于基因重组抗Covid-19和其他冠状病毒IgY抗体制备及应用制造技术

本发明专利技术公开了基于基因重组抗Covid

【技术实现步骤摘要】
基于基因重组抗Covid
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19和其他冠状病毒IgY抗体制备及应用


[0001]本专利技术涉及抗体产业化应用，特别涉及基于基因重组抗Covid
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19和其他冠状病毒IgY抗体的制备及应用，属于生物


技术介绍

[0002]新型冠状病毒Covid
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19属于β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形 或椭圆形，常为多形性，直径60
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140nm，是目前已知的可以感染人的第7种冠状 病毒，其余6种冠状病毒分别是HCoV
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229E、HCoV
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OC43、HCoV
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NL63、HCoV
‑ꢀ
HKU1、SARS
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CoV和MERS
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CoV。其中前4种在人群中较为常见，致病性较低， 一般仅引起类似普通感冒的轻微呼吸道症状；另外2种是SARS冠状病毒和MERS 冠状病毒(中东呼吸综合症冠状病毒)。
[0003]抗体是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质。它（免疫球蛋白不仅仅只是抗体）是一种由浆细胞（效应B细胞）分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质，仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其B细胞的细胞膜表面，抗体能识别特定外来物的一个独特特征，该外来目标被称为抗原。
[0004]在COVID
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19中，病毒表面的S蛋白介导受体识别和膜融合，在病毒感染过程中，三聚体S蛋白被切割成S1和S2亚基，S1蛋白的受体结合域（RBD），直接与靶细胞表面受体ACE2的肽酶域（peptidase domain，PD）结合，而S2负责膜融合，但是目前通过无法实现通过构建和表达S蛋白实现对SARS
‑
CoV特异性IgY抗体的生产。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供基于基因重组抗Covid
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19和其他冠状病毒IgY抗体的制备及应用，以解决上述
技术介绍
中提出的目前通过无法实现通过构建和表达S蛋白实现对SARS
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CoV特异性IgY抗体的生产的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：包括以下步骤：S1：新冠病毒S蛋白基因的克隆表达；根据已知探针克隆新冠病毒S蛋白基因，首先将探针作放射性或非放射性标记，再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交，最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体；S2：抗原的制备，通过生物反应器进行昆虫细胞的杆状病毒昆虫细胞表达、用杆状病毒昆虫细胞表达系统，并使用悬浮培养Sf9细胞等进行表达和大规模无血清悬浮培养制备，所获产品的抗原性，His
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tag（多聚组氨酸标签）纯化、确保抗原的纯度保持在90
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93%；S3：动物的选择，选择高产母鸡，鸡龄为刚产蛋的鸡龄为最佳；S4：对选择的动物进行免疫，使用油佐剂ECMS、免疫增强剂免疫，将免疫剂量 1 mL，每只鸡每次两翼双翅与胸部肌肉四点注射，免疫的次数为3次，免疫的周期为2个月左右，第三次免疫结束后，时间间隔为2周后收集免疫母鸡生产的鸡蛋；S5：对母鸡进行抗体的检测，用ELISA（酶联免疫吸附测定）方法测每只鸡抗体的产
生与否及滴度，ELISA测OD（光密度）值，公式为：样品OD值/阴性对照OD值>2.1判断为阳性,以最小阳性值对应孔的稀释倍数的倒数为最高滴度,并制作免疫周期内抗体滴度变化表；S6：特异性IgY抗体的分离和纯化：分离收集蛋的蛋黄液，并加入8
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10倍体积的PBS缓冲液，随后加入3.5％(w/v)的PEG
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6000，静置30
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40min，经离心后20
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30min；采用脱脂棉过滤上清液，同时向上清液中加入硫酸铵盐析，使硫酸铵的饱和度达35％
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45％，在3
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4℃下静置10
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12h；静置后离心，弃去上清液，得到沉淀物，按每毫升沉淀物加5
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7ml PBS缓冲液溶解得到溶解液；将溶解液装入透析袋用蒸馏水透析除铵离子，最后一次改用PBS缓冲液透析；透析液除菌过滤，加入添加剂，调节IgY（鸡卵黄免疫球蛋白）含量，并进行定容，定容时长为12小时，对定容的蛋黄加入0.45um、0.22um膜过滤除菌；a10：通过巴斯德消毒，控制消毒时间为0.5小时，消毒后进行灌装打包；S7：抗体含量的测定，抗体纯度的测定；S8：加入各种添加剂，包括防腐剂和稳定剂；调整IgY含量大于3mg/ml，0.2um滤膜过滤除菌、病毒灭活后灌装。
[0007]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤s8中加入添加剂，调节IgY（鸡卵黄免疫球蛋白）含量，对步骤s6过滤后的稀释蛋黄添加氧化钠试剂，加入氧化钠试剂和进行沉淀，沉淀后进行定容，保证IgY（鸡卵黄免疫球蛋白）含量在90%左右。
[0008]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤S7中IgY纯度的测定，包括电泳、SEC、结合活性、假病毒中和活性、ACE2竞争活性和HPLC法。
[0009]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术基于基因重组抗Covid
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19和其他冠状病毒IgY抗体及其他小分子抗体产业化应用，通过构建和表达S蛋白，纯化获得高纯度抗原蛋白免疫母鸡，使鸡蛋中持续产生特异性的针对S蛋白的特异性卵黄抗体，经过纯化提取针对SARS
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CoV特异性IgY抗体，制备成喷雾剂，用于人口腔喷雾消毒。
附图说明
[0010]图1为本专利技术的工艺流程图；图2为本专利技术的IgY抗体纯化流程图；图3为本专利技术的HPLC法IgY蛋白纯度检测图；图4为本专利技术图ELISA法检测SARS
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COV2
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RBD蛋白和抗体结合活性检测图；图5为本专利技术的IgY和SEC活性图图6为本专利技术的IgY与RBD S1h结合活性图；图7为本专利技术的IgY假病毒中活性图。
实施方式
[0011]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0012]请参阅图1
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7，本实施例提供了基于基因重组抗Covid
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19和其他
冠状病毒IgY抗体的制备包括以下步骤：S1：新冠病毒S蛋白基因的克隆表达；S2：抗原的制备，通过生物反应器进行昆虫细胞的杆状病毒昆虫细胞表达、用杆状病毒昆虫细胞表达系统，并使用悬浮培养Sf9细胞等进行表达和大规模无血清悬浮培养制备，所获产品的抗原性，His
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tag（多聚组氨酸标签）纯化、确保抗原的纯度保持在90
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于基因重组抗Covid
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19和其他冠状病毒IgY抗体制备，其特征在于，具体制备方法包括以下步骤：S1：新冠病毒S蛋白基因的克隆表达；根据已知探针克隆新冠病毒S蛋白基因，首先将探针作放射性或非放射性标记，再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交，最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体；S2：抗原的制备，通过生物反应器进行昆虫细胞的杆状病毒昆虫细胞表达、用杆状病毒昆虫细胞表达系统，并使用悬浮培养Sf9细胞等进行表达和大规模无血清悬浮培养制备，所获产品的抗原性，His
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tag(多聚组氨酸标签)纯化、确保抗原的纯度保持在90
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93％；S3：动物的选择，选择高产母鸡，鸡龄为刚产蛋的鸡龄为最佳；S4：对选择的动物进行免疫，使用油佐剂ECMS、免疫增强剂免疫，将免疫剂量1mL，每只鸡每次两翼双翅与胸部肌肉四点注射，免疫的次数为3次，免疫的周期为2个月左右，第三次免疫结束后，时间间隔为2周后收集免疫母鸡生产的鸡蛋；S5：对母鸡进行抗体的检测，用ELISA(酶联免疫吸附测定)方法测每只鸡抗体的产生与否及滴度，ELISA测OD(光密度)值，公式为：样品OD值/阴性对照OD值>2.1判断为阳性,以最小阳性值对应孔的稀释倍数的倒数为最高滴度,并制作免疫周期内抗体滴度变化表；S6：特异性IgY抗体的分离和纯化：S7：抗体含量的测定，抗体纯度的测定；S8：加入各种添加剂，包括防腐剂和稳定剂；调整IgY含量大于3mg/ml，0.2um滤膜过滤除菌、病毒灭活后灌装。2.根据权利要求1所述的基于基因重组抗Covid
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19和其他冠状病毒IgY抗体制备，其特征在于：所述的S6步骤具体方法为：所述分离收集蛋的蛋黄液...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁士元，梁永明，徐天辉，徐乃尧，高子亚，卢慧玲，
申请(专利权)人：上海亚健医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：