一种编码猪链球菌保护性抗原的基因序列、蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种编码猪链球菌保护性抗原的基因序列、蛋白及其应用。本发明专利技术通过人工合成SEQ.No:1所示的核苷酸序列；使用带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物对对核苷酸序列进行扩增，得到目的基因PCR产物和pET

【技术实现步骤摘要】
一种编码猪链球菌保护性抗原的基因序列、蛋白及其应用


[0001]本专利技术涉及一种编码猪链球菌保护性抗原的基因序列、蛋白及其应用。

技术介绍

[0002]猪链球菌在自然界中分布广泛，血清型种类繁多，不仅猪、马、牛、羊及家禽都可以成为其感染宿主，还可以导致人的感染，是一种重要的人畜共患病。猪链球菌是一种革兰氏阳性兼性厌氧菌，作为一种条件致病菌，广泛存在于宿主的呼吸道、消化道和生殖道中。在早期感染病原时，宿主会出现发热、精神萎靡等症状。主要的临床症状表现为淋巴结局部化脓性病症和败血症。目前根据荚膜多糖的不同，将猪链球菌分为35个血清型(1/2,1～34型)，但仍有相当数量的猪链球菌菌株无法定型，其中猪链球菌2型、7型及9型是常见致病的血清型，猪链球菌2型是临床上分离的最多的血清型，毒力最强。
[0003]猪链球菌病的治疗目前主要依赖于抗生素，但是长期使用抗生素会导致菌株产生耐药性，因此应对猪链球菌应该采取更加科学的方法，随着生物技术的不断发展，基因工程疫苗的开发越来越受到重视，猪链球菌基因工程苗亚单位疫苗重要的一步是保护性抗原的筛选。
[0004]刘丽娜通过对中国和荷兰的4株猪链球菌的基因比对分析，发现RfeA基因相似性为100％，推测该基因非常保守。通过原核表达后的蛋白免疫小鼠后，用2型强毒株OSZYH33攻击，结果表明RfeA免疫组的小鼠存活率为90％，明显高于对照组，说明该蛋白具有较好的免疫原性。位于细胞表面的HP0245，经过原核表达后，免疫原性分析后发现，在高剂量的SS2攻毒时能提供80％的保护力，同源的HP0245基因与编码胞外肤段的高度保守序列存在于大部分SS标准菌株中，因此HP0245能够成为研制亚单位疫苗的候选蛋白。Enolase被证实在所有血清型的猪链球菌中都有表达，是一段高度保守的序列。有研究证实在小鼠模型上，用特殊佐剂乳化的Enolase，可诱导显著的体液免疫应答，并可以为致死剂量的SS2和SS7的感染提供有效保护。

技术实现思路

[0005]现有技术中猪链球菌保护性抗原仅对2型强毒株具有保护作用，对其他类型的猪链球菌效果不佳，为克服上述技术不足，本专利技术提供一种猪链球菌广谱保护性抗原(amino acid ABC transporter substrate
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binding protein)aa
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ABC及其基因序列，并公开其制备方法及应用。本专利技术通过人工合成SEQ.No:1所示的核苷酸序列；使用带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物对对核苷酸序列进行扩增，得到目的基因PCR产物和pET
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28a阳性质粒使用EcoRⅠ和XhoⅠ酶进行双酶切处理后连接后，诱导重组蛋白aa
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ABC的表达，得到保护性抗原aa
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ABC，其可以显著提高小鼠的抗体水平。
[0006]本专利技术上述技术效果通过下述技术方案实现：
[0007]本专利技术目的之一在于提供一种编码猪链球菌保护性抗原的基因序列及其蛋白，该基因序列编码猪链球菌广谱保护性抗原(amino acid ABC transporter substrate
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binding protein)，命名为aa
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ABC，其核苷酸编码序列如SEQ.No:1所示。本专利技术中上述核苷酸编码序列由上海派森诺生物限公司完成合成得到。本专利技术还请求上述所述基因序列对应的猪链球菌保护性抗原蛋白。
[0008]本专利技术目的之二在于提供上述猪链球菌保护性抗原的制备方法，其包括如下步骤：
[0009]1)人工合成SEQ.No:1所示的猪链球菌保护性抗原aa
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ABC核苷酸序列；使用带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物对对核苷酸序列进行扩增，其中正向引物如SEQ.No:2所示，反向引物如SEQ.No:3所示；扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化，得到目的基因PCR产物；
[0010]2)构建重组质粒pET28a
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aa
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ABC：使用EcoRⅠ和XhoⅠ酶对目的基因PCR产物和pET
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28a阳性质粒分别进行双酶切处理；回收经双酶切处理的aa
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ABC基因和pET
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28a阳性质粒在16℃金属浴过夜进行连接反应；
[0011]3)连接产物测序鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，将转化后的感受态细胞转接于具有Kan抗性的LB液体培养基中逐级培养，培养温度为37℃；
[0012]4)控制培养温度、培养时间和IPTG的浓度诱导重组蛋白的表达，上清液收集后经镍柱纯化和富集除盐，得到重组蛋白的大小为32kDa的aa
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ABC抗原，利用Western Blot验证其抗原性。
[0013]如上所述的猪链球菌保护性抗原aa
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ABC的制备方法，其中步骤1)中扩增体系的组成如下：LA Taq酶25μL，正向引物1μL，反向引物1μL；模板2μL，ddH2O 21μL，PCR扩增条件为：95℃预变性2min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环，72℃延伸10min。
[0014]如上所述的猪链球菌保护性抗原aa
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ABC的制备方法，所述步骤2)中目的基因PCR产物的酶切体系的组成为：10
×
Buffer 2μL，aa
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ABC基因9μL，EcoRⅠ酶0.5μL，XhoⅠ酶0.5μL，ddH2O 8μL；pET
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28a质粒的酶切体系的组成为10
×
Buffer 2μL，pET
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28a质粒9μL，EcoRⅠ酶0.5μL，XhoⅠ酶0.5μL，ddH2O 8μL。
[0015]如上所述的猪链球菌保护性抗原aa
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ABC的制备方法，所述步骤2)中连接反应体系的组成为：10
×
Buffer 1μL，aa
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ABC基因7μL，pET
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28a质粒1.5μL，T4 DNA连接酶0.5μL。
[0016]如上所述的猪链球菌保护性抗原aa
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ABC的制备方法，所述步骤3)中测序鉴定步骤具体包括：连接反应产物转化到感受态细胞DH5α,转化后菌液涂在卡那霉素的LB琼脂平板上培养，挑取单菌落转接到LB液体培养基，收集菌液并提取质粒进行测序，并与目的片段进行比对分析。
[0017]如上所述的猪链球菌保护性抗原aa
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ABC的制备方法中，所述的连接产物转化鉴定具体包括下述步骤：
[0018]将连接产物加入到解冻完成的感受态细胞中，42℃水浴热激90s，立即置于冰上2min；室温条件下加入LB培养基，200rpm，37℃下振荡培养1h；将培养完成的感受态细胞培养液8000rpm离心2min后弃去上清，使用培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种编码猪链球菌保护性抗原的基因序列，其核苷酸序列如SEQ.No:1所示。2.权利要求1所述的基因序列对应的猪链球菌保护性抗原蛋白。3.权利要求1所述的猪链球菌保护性抗原的制备方法，其包括如下步骤：1)人工合成SEQ.No:1所示的猪链球菌保护性抗原aa
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ABC核苷酸序列；；使用带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物对对核苷酸序列进行扩增，其中正向引物如SEQ.No:2所示，反向引物如SEQ.No:3所示；扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化，得到目的基因PCR产物；2)构建重组质粒pET28a
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aa
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ABC：使用EcoRⅠ和XhoⅠ酶对目的基因PCR产物和pET
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28a阳性质粒进行双酶切处理；回收经过双酶切处理过的aa
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ABC基因和pET
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28a阳性质粒在16℃金属浴过夜进行连接反应；3)连接产物测序鉴定后转化到大肠杆菌BL21中，将转化后的感受态细胞转接于具有Kan抗性的LB液体培养基中逐级培养，培养温度为37℃；4)控制培养温度、培养时间和IPTG的浓度诱导重组蛋白的表达，收集其上清液，经镍柱纯化和富集除盐后得到重组蛋白的大小为32kDa的aa
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ABC抗原，利用Western Blot验证其抗原性。4.根据权利要求2所述的猪链球菌保护性抗原aa
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ABC的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中扩增体系的组成如下：LA Taq酶25μL，正向引物1μL，反向引物1μL；模板2μL，ddH2O 21μL，PCR扩增条件为：95℃预变性2min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环，72℃延伸10min。5.根据权利要求2所述的猪...

【专利技术属性】
技术研发人员：李蓓蓓，马志永，闫祖杰，姚晓慧，聂万森，李宗杰，邱亚峰，魏建超，刘珂，邵东华，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心，
类型：发明
国别省市：