一种来源于巴西蘑菇的耐镉基因AbYCF1及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种来源于巴西蘑菇的耐镉基因AbYCF1及其应用。所述耐镉基因AbYCF1的ORF全长序列如SEQ ID NO.1所示，其是从巴西蘑菇菌株J77（低Cd积累菌株）中克隆得到的。将耐镉基因AbYCF1的ORF全长序列构建表达载体并转化到酵母细胞中，发现该基因可以显著提高酵母耐镉能力。本发明专利技术对于研究真菌耐镉性及耐镉巴西蘑菇新品种选育具有重要意义。蘑菇新品种选育具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种来源于巴西蘑菇的耐镉基因AbYCF1及其应用


[0001]本专利技术属于生物技术及环境保护领域，具体涉及一种来源于巴西蘑菇的耐镉基因AbYCF1及其应用。

技术介绍

[0002]巴西蘑菇又名姬松茸，是一种原产于巴西的食药兼用真菌，其多糖对人体有很多益处。但其菌丝体对镉的富集能力很强，容易导致镉在子实体中的积累超标，影响食品安全和出口外汇。目前，由于新“三品一标”的出台，国家对环境和食品安全的管控越来越严格。因此，探索一种具有调控镉迁移的基因具有必要性和重要意义。
[0003]本专利技术通过比较巴西蘑菇镉耐受性差异菌株J77和J1转录组数据，发现镉耐受性差异的关键候选基因，通过生物信息学分析，克隆到该基因全长，构建表达载体转化到酵母细胞中，发现该基因可以显著提高酵母耐镉能力。本专利技术对于研究真菌耐镉性及耐镉巴西蘑菇新品种选育具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种来源于巴西蘑菇的耐镉基因AbYCF1及其应用。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种来源于巴西蘑菇的耐镉基因AbYCF1，所述耐镉基因AbYCF1的ORF全长序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0006]一种含有上述耐镉基因AbYCF1的表达载体。
[0007]一种扩增上述耐镉基因AbYCF1的引物，所述引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示。
[0008]耐镉基因AbYCF1在提高真菌耐镉性方面的应用，所述真菌为酵母菌、巴西蘑菇。
[0009]耐镉基因AbYCF1在耐镉巴西蘑菇新品种选育方面的应用。
[0010]本专利技术的显著优点在于：本专利技术的AbYCF1基因可以显著提高真菌的耐镉性，为人为控制耐镉相关基因的表达提供了基础，将在耐镉性增强的真菌培育中发挥重要的作用。
附图说明
[0011]图1：AbYCF1基因在巴西蘑菇菌株J77和巴西蘑菇菌株J1中的差异表达。
[0012]图2：巴西蘑菇RNA(A)和AbYCF1基因PCR(B)电泳图。
[0013]图3：转基因菌株及原菌株耐镉性比较。
具体实施方式
[0014]为了使本专利技术所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本专利技术所述的技术方案做进一步的说明，但是本专利技术不仅限于此。
[0015]实施例1本专利技术申请人前期研究发现，巴西蘑菇菌株J77为低Cd积累菌株，而巴西蘑菇菌株J1为高Cd积累菌株，镉胁迫下J77和J1中AbYCF1基因表达量差异显著(图1)，由此推测AbYCF1基因与巴西蘑菇镉积累和耐受性相关；其中，所述巴西蘑菇菌株J77的AbYCF1基因的ORF全长序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0016]1.AbYCF1基因克隆1.1菌丝体培养(1)PDA加富培养基配方为：马铃薯230g、蔗糖20g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁0.5g、维生素B110mg，加蒸馏水定容至1L，放入高压灭菌锅120℃灭菌20min，冷却至常温后备用。
[0017](2)菌丝样品：将巴西蘑菇菌株J77的试管种接种于PDA加富液体培养基中，25℃静培养20d后收集菌丝，以液氮迅速冷冻菌丝体并保存于
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80℃冰箱待用。
[0018]1.2RNA提取及第一链cDNA合成菌丝体RNA的提取采用诺唯赞RNA
‑
easyTM Isolation Reagent R701试剂盒，具体步骤参照试剂盒操作说明进行，本研究使用方法略有改动：(1)研钵和研杵预先用液氮冷却，取出液氮中保存的菌丝体，液氮中磨成粉末状。
[0019](2)将研磨后的样品移至无菌离心管中，每25mg菌丝粉末添加500μL RNA
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easy(RNA
‑
easy Isolation Reagent)，并用移液枪吹打均匀，使样品充分裂解。
[0020](3)向离心管中加入200μL RNase
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free ddH2O，上下颠倒混匀，室温静置10min，12000
×
g室温离心15min。
[0021](4)从离心机中取出离心管，此时管中液体分成两层，上层水相(含RNA)和下层沉淀(含蛋白质、DNA、多糖等杂质)，弃去下层沉淀，小心吸取上层水相移至一个新的离心管中(一定不能取到下层沉淀，容易杂质污染)。
[0022](5)向离心管中加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置20min，12000
×
g室温离心10min，可观察到少量白色沉淀，小心弃去上清。
[0023](6)向沉淀中加入500μL 75％乙醇(RNase
‑
free ddH2O配制)，使用移液枪吹打离心管管壁，让沉淀悬浮起来，并上下颠倒数次，8000
×
g室温离心3min，弃去全部上清。
[0024](7)室温放置3min，加入40μL RNase
‑
free ddH2O快速溶解沉淀，使用移液器轻轻反复吹打，使RNA沉淀充分溶解。提取的RNA产物分装后在
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85～
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65℃长期保存。
[0025]cDNA合成：使用前将各组分点甩离心。在RNase
‑
free PCR管中建立以下反应体系和反应条件：表1cDNA合成反应体系
表2cDNA合成反应温度1.3AbYCF1基因ORF序列全长扩增(1)根据转录组测序得到的AbYCF1基因序列，采用Primer Premier 5.0软件设计两条特异性引物(见表3)，引物合成由福州博尚生物技术有限公司完成，利用两条特异性引物对巴西蘑菇菌株J77的AbYCF1基因ORF序列全长扩增。
[0026]表3AbYCF1基因扩增引物(2)PCR扩增目的基因，反应体系和反应条件见表：表4PCR反应体系表4PCR反应体系表5PCR反应条件
(3)PCR产物的回收，将反应结束后得到PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(图2)，Gel Green染色，如果条带特异且大小符合片段大小则可以进行切胶回收和纯化。具体步骤参照Biospin胶回收和PCR产物纯化试剂盒说明书进行。
[0027](4)纯化后的PCR产物按照下表的体系在37℃条件下与克隆载体连接30min。
[0028]表6克隆载体连接体系(5)取大肠杆菌Trans1
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T1感受态细胞放置冰盒融化，将连接产物与50μL融化了的Trans1
‑
T1感受态细胞轻轻混匀，冰浴30min；以胶回收液加入50μL融化了的Trans1
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T1感受态细胞作为阴性对照；冰浴结束后42℃水浴热激30s，立即放入冰盒静置2min；加入250μL普通LB液体培养基，在37℃、200r
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min
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种来源于巴西蘑菇的耐镉基因AbYCF1，其特征在于：所述耐镉基因AbYCF1的ORF全长序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的耐镉基因AbYCF1，其特征在于：其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种含有权利要求1所述的耐镉基因AbYCF1的表达载体。4.一种扩增权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘朋虎，周宇，翁伯琦，林冬梅，林占熺，陈华，王义祥，李晶，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：