干酪乳杆菌MucBP基因及其编码蛋白在制备抑制结肠癌细胞增殖产品中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，提供了干酪乳杆菌MucBP基因及其编码蛋白在制备抑制结肠癌细胞增殖产品中的应用。所述MucBP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述MucBP基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。MucBP基因编码的蛋白质能够显著抑制HT29细胞增殖，且在25～200μg/mL的作用浓度下均有效，为后续研制抑制癌细胞增殖的产品提供新思路。续研制抑制癌细胞增殖的产品提供新思路。续研制抑制癌细胞增殖的产品提供新思路。

【技术实现步骤摘要】
干酪乳杆菌MucBP基因及其编码蛋白在制备抑制结肠癌细胞增殖产品中的应用


[0001]本专利技术涉及生物领域，尤其涉及干酪乳杆菌MucBP基因及其编码蛋白在制备抑制结肠癌细胞增殖产品中的应用。

技术介绍

[0002]肠道菌群在人体生理中发挥着越来越重要的作用，一般认为肠道菌群产生的短链脂肪酸(SCFAs)是其与宿主之间的桥梁。肠腔内短链脂肪酸的产生和肝脏对短链脂肪酸的利用达到一个肠腔到外周的浓度梯度，在此期间上皮细胞选择性摄取丁酸，肝脏选择性摄取丙酸，外周选择性摄取乙酸。然而，目前尚未发现肠道菌群与宿主之间是否存在其他相互作用的模式。
[0003]结肠外粘液层由共生菌组成，主要成分为形成凝胶的大粘蛋白。干酪乳杆菌是人类结肠粘蛋白层表面最早的定居菌之一，作为乳酸菌的一种，它具有维持肠道完整性、防止肠道肿瘤、诱导胃癌细胞凋亡、减轻肝脏炎症、调节免疫反应、降低血脂和胆固醇、缓解胰岛素抵抗和糖尿病、改善学习记忆障碍等多重益生菌作用。通常有一种表达在细菌外表面的蛋白与结肠内的粘液结合，如肺炎链球菌、嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌。乳酸乳球菌亚种的两种黏附蛋白参与胃肠道细菌的定植，AggL蛋白促进细菌对粘膜组织的非特异性疏水黏附，而粘液结合蛋白(MucBP)与胃粘蛋白结合。在所有已知基因组的干酪乳杆菌中，均存在一个LevH1基因编码的蛋白，该蛋白具有GH32菊粉酶活性、粘液结合活性和Ig样结构域。干酪乳杆菌表面的LevH1蛋白中的粘液结合活性域极有可能与宿主的粘液蛋白结合。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供干酪乳杆菌MucBP基因及其编码蛋白在制备抑制结肠癌细胞增殖产品中的应用，MucBP基因编码的蛋白质能够显著抑制HT29细胞增殖，为后续研制抑制癌细胞增殖的产品提供新思路。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了干酪乳杆菌MucBP基因，所述MucBP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]本专利技术还提供了干酪乳杆菌MucBP基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术还提供了上述的干酪乳杆菌MucBP基因编码的蛋白质在制备抑制癌细胞增殖产品中的应用。
[0009]优选的，所述癌细胞包括结肠癌细胞。
[0010]优选的，所述干酪乳杆菌MucBP基因编码的蛋白质的作用浓度为25～200μg/mL。
[0011]相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0012]本专利技术的MucBP蛋白能够显著抑制HT29细胞增殖，且在25～200μg/mL的作用浓度
下均有效，而定点突变后的MucBP
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蛋白就失去了抑制HT29细胞增殖的活性，说明本专利技术MucBP蛋白可以特异性抑制结肠癌细胞增殖，为后续研制抑制癌细胞增殖的产品提供新思路。
附图说明
[0013]图1为MucBP基因和MucBP蛋白检测图；
[0014]图2为MucBP蛋白结构图；
[0015]图3为不同浓度蛋白处理HT
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29细胞后的细胞活力图。
具体实施方式
[0016]本专利技术提供了干酪乳杆菌MucBP基因，所述MucBP基因的核苷酸序列如下所示：
[0017]ATGATTACCAGCATTTGGAACAGCACCGGCCAGCTGACCGAAAAATTTGTGGATGAAAACGGCAACACCATTGCGAGCGATAAAATTCAGACCGGCCGCGTGGGCCAGCGCTATACTAGCGAAAGCGCGACCATTCCGGGCTATGTGTTTGTGAAAGAAAACACCGATCATATCAACAGCAACCAGCTGTATACCACCCAGAACCAGACCATTACCTATACCTATCGCGCGAGCCAGGCGAGCGTTGTGGGTAGCGGTTCACATCATCATCATCATCATTAA。
[0018]本专利技术还提供了干酪乳杆菌MucBP基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如下所示：
[0019]MITSIWNSTGQLTEKFVDENGNTIASDKIQTGRVGQRYTSESATIPGY VFVKENTDHINSNQLYTTQNQTITYTYRASQASVVGSGSHHHHHH。
[0020]本专利技术还提供了上述的干酪乳杆菌MucBP基因编码的蛋白质在制备抑制癌细胞增殖产品中的应用。
[0021]在本专利技术中，所述癌细胞包括结肠癌细胞，优选的，所述结肠癌细胞为HT
‑
29细胞。
[0022]在本专利技术中，所述干酪乳杆菌MucBP基因编码的蛋白质的作用浓度为25～200μg/mL，优选为50～150μg/mL，进一步优选为80～100μg/mL。
[0023]下面结合实施例对本专利技术提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。
[0024]实施例1干酪乳杆菌MucBP蛋白的纯化与结构探究
[0025]检索不同干酪乳杆菌菌株的LevH1基因序列(GeneBank，AB185852.1)，并根据MucBP序列的区域设计克隆引物：
[0026]上游引物(SEQ ID NO.3)：5'
‑
CATCATCATCATCATTCTTCTGGTATT ACTTCAATTTGGAACAGTACTG
‑
3'；
[0027]下游引物(SEQ ID NO.4)：5'
‑
CTCCTGGATCTCGCGCTCATACAAC AGACGCTTGGGACG
‑
3'。
[0028]以干酪乳杆菌CAUH35(购自美国菌种保藏中心ATCC)的基因组DN A为模板，在Pfu DNA聚合酶(生工生物技术，上海，中国)存在的情况下，扩增MucBP基因，反应体系见表1：
[0029]表1.PCR扩增MucBP基因片段的反应体系(50μL)
[0030][0031]扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，56.7℃退火15s，72℃延伸5min，变性、退火、延伸进行35个循环；72℃最终延伸5min。扩增的MucBP基因经琼脂糖凝胶电泳纯化后，可见250bp左右的条带(图1中的左图)。在60.8℃退火温度下整合到pET
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30b质粒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)上，反应体系见表2：
[0032]表2.PCR构建MucBP表达载体的反应体系(25μL)
[0033][0034]质粒测序后转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)中，具体步骤如下：从
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80℃冰箱中取出一支大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(100μL)，迅速插入冰盒中溶解，向感受态细胞中加入1μL质粒，冰中放置30min，42℃水浴热激45s，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.干酪乳杆菌MucBP基因，其特征在于，所述MucBP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.干酪乳杆菌MucBP基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.权利要求1所述的干酪乳杆菌MucBP...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨栋，琚璇，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：