一种烟曲霉AF-hypo基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种烟曲霉AF

【技术实现步骤摘要】
一种烟曲霉AF
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hypo基因及其应用


[0001]本专利技术涉及一种烟曲霉AF
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hypo基因，以及在缺失AF
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hypo基因后导致烟曲霉对伏立康唑的敏感性增强的用途，属于基因工程领域。

技术介绍

[0002]近年来,随着免疫抑制、化疗药物、骨髓移植和实体器官移植的增加，侵袭性真菌感染的发病率也随之上升。对人类有致病作用的真菌主要有曲霉、念珠菌、镰刀菌、毛霉等，在曲霉感染中以烟曲霉（Aspergillus fumigatus）最为常见。由烟曲霉引起的侵袭性曲霉病病死率高，已成为该类患者最常见的死亡原因。并且即使经过有效的抗真菌药物治疗，死亡率仍可高达50%。其中部分原因就是致病曲霉的耐药，包括耐伏立康唑的烟曲霉或者对唑类多重耐药的烟曲霉，常常导致一线抗真菌药物伏立康唑的治疗失败。因此，逆转烟曲霉的耐药性、研发新型的唑类药物增敏剂及探索相关的靶点，是提高临床治愈率的重要途径。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于：提供一种烟曲霉基因片段，以该基因的缺失对伏立康唑药物敏感性的影响情况，作为靶向药物设计的靶点方向，或者作为新型抗真菌药物的筛选标记，进而找到新型抗烟曲霉病的药物。
[0004]本专利技术的技术方案是：一种烟曲霉AF
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hypo基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，来源于烟曲霉（Aspergillus Fumigates 293），在NCBI基因库中的编号为AFUA_1G07360（Gene ID: 3507742），包含684个碱基；上述基因能降低对伏立康唑的敏感性；上述烟曲霉AF
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hypo基因作为靶基因在制备或筛选曲霉病治疗药物中的应用；本专利技术的烟曲霉AF
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hypo基因，可用于构建烟曲霉AF
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hypo基因缺陷株，所述的烟曲霉AF
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hypo基因缺陷株为伏立康唑敏感株。在所述烟曲霉AF
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hypo基因缺陷株中AF
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hypo基因不表达。
[0005]本专利技术的优点在于：本专利技术所述的AF
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hypo基因是伏立康唑敏感性相关基因，基因敲除后能降低对伏立康唑的敏感性。设计以AF
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hypo基因为靶基因的药物，包括能够诱导AF
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hypo基因低表达或以AF
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hypo基因表达蛋白为拮抗对象的药物，或者以AF
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hypo基因为靶点，筛选能够使该基因表达下调的药物进而运用到烟曲霉的治疗手段中。
附图说明
[0006]图1为基因敲除载体的构建策略；图2为AF
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hypo基因左右侧翼和中间段pyrG的琼脂糖凝胶电泳结果，左右侧翼长度约为1.2kb，中间段长度约为1.5kb；
图3为融合PCR产物的结果，长度约为4.0kb；图4为验证阳性转化子
△
AF
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hypo的结果，长度约为1.35kb；图5为烟曲霉野生株AF293和
△
AF
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hypo对伏立康唑的E
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test结果。
[0007]具体实施措施下面结合附图和具体实施方式对本专利技术做进一步说明，下列实施方式只是说明性的，并不限制本专利技术的保护范围。下列实施方式的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0008]实验菌株见表1，构建基因敲除载体用到的引物见表2，验证阳性转化子用到的引物见表3。
[0009]表1表2
post的获取：用于同源重组的敲除DNA片段AF
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hypo pre
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pyrG
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AF
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hypo post的获得策略见图1；1.1扩增AF
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hypo pre
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pyrG
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AF
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hypo post各片段；分别以P1+P2及P3+p4为引物，PCR扩增烟曲霉AF293的基因组DNA(OMEGA
ꢀ®
Fungal DNA Kit真菌DNA提取试剂盒)中基因片段，得到如SEQ ID No.2所示左侧翼序列AF
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hypo pre和如SEQ ID No.3所示右侧翼序列AF
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hypo post，并将所得产物纯化（MolPure
®ꢀ
PCR Purification Kit PCR产物纯化试剂盒)，经1%琼脂糖凝胶电泳验证后备用。扩增条件为：94℃，4.5min；(94℃，30s；54℃，30s；72℃，1 min)30个循环；72℃，10min。
[0015]1.2以p5+p6扩增质粒pLAX223 DNA（MolPure
®ꢀ
Plasmid Mini Kit 质粒小量提取试剂盒）中基因片段，得到 由序列表中SEQ ID No.4所示的筛选标记pyrG，回收约1.5kb的产物，得到中间段产物pyrG，并将所得产物纯化（MolPure
®ꢀ
PCR Purification Kit PCR产物纯化试剂盒），经1%琼脂糖凝胶电泳验证后备用。扩增条件为：95℃，2min；(95℃，30s；55℃，30s；68℃，1 .5min)35个循环；68℃，5min。
[0016]1.3 AF
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hypo pre、pyrG、AF
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hypo post三个片段的融合。
[0017]降落PCR可用于三个片段的融合，融合板块分为AF
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hypo pre、pyrG、AF
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hypo post，引物为p7+p8，融合完成后得到重组表达载体AF
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hypo pre
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pyrG
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AF
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hypo post，并经1%琼脂糖凝胶电泳验证后备用。其扩增条件为：95℃，2min；(95℃，30s；70℃，1s；55℃，30s；72℃，3min50s)35个循环；72℃，5min。
[0018]1.4纯化产物的验证纯化产物结果如图2所示。图 2中，泳道M为Marker，泳道1和2分别为左右侧翼游产物AF
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hypo pre、AF
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hypo pos，长度约为1.2kb。泳道3为中间片段pyrG，长度约为1.5kb。图3中，泳道M为Marker,泳道1为融合PCR产物的AF
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hypo pre
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pyrG
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AF
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hypo post，长度约为4.0kb。
[0019]步骤2：烟曲霉缺陷株的转化和敲除株
△
AF
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hypo的获取烟曲霉转化用的宿主本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种烟曲霉AF
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hypo基因，特征在于：所述的烟曲霉AF
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hypo基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的一种烟曲霉AF
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hypo基因，其特征在于：所述的烟...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭举方，沈敏，张恒，孙毅，
申请(专利权)人：荆州市中心医院长江大学附属荆州医院，
类型：发明
国别省市：