一种烟曲霉ABC转运蛋白的Af-ABC基因及其应用制造技术

本发明专利技术采用同源重组的基因敲除方法敲除获得烟曲霉中一种ABC转运蛋白编码基因序列为Af

【技术实现步骤摘要】
一种烟曲霉ABC转运蛋白的Af
‑
ABC基因及其应用


[0001]本专利技术属于ABC转运蛋白的
，具体涉及一种烟曲霉ABC转运蛋白的Af
‑
ABC基因及其应用。

技术介绍

[0002]近年来，随着血液系统疾病、恶性肿瘤、HIV/AIDS、自身免疫性疾病的增多，广谱抗生素的滥用,以及糖皮质激素、免疫制剂的广泛应用，侵袭性曲霉病的发生率显著增高。即使在现代医学高速发展的今天，侵袭性曲霉病仍是导致这类患者死亡的一个重要原因，其病死率高达60％～100％。
[0003]目前抗真菌药物数量和种类都十分有限，对侵袭性曲霉病的防治效果非常不理想。一线治疗药物伏立康唑的有效率仅为52.8%，经典抗真菌药物两性霉素B的有效率仅为31.6％。此外，主要致病菌烟曲霉对现有抗真菌药物的耐药现象使得侵袭性曲霉病的治疗更受限制。在欧洲国家，临床分离获得的三唑类耐药烟曲霉约占7%，且这一比例呈上升趋势；更为重要的是在这些耐药菌株当中，对伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑交叉耐药的菌株占到了80%以上；因此，研发新型抗真菌药物靶点及寻找提高现有抗真菌药物的杀菌活性对于提高临床预后十分重要。
[0004]ABC转运蛋白（ABC transport）是生物细胞膜上一种运输ATP酶（transport ATPase），广泛存在于微生物到人类所有生物体细胞中。ABC转运蛋白通过结合并水解ATP实现各种分子在细胞膜上的转运。
[0005]在真菌细胞当中，ABC转运蛋白也是分子、化合物进出真菌细胞的关键蛋白。为了研究ABC转运蛋白的功能以及对烟曲霉药物敏感性和相关表型的影响，有必要找出烟曲霉ABC转运蛋白的影响烟曲霉药物敏感性的基因，用来研究新型抗真菌药物靶点以及寻找提高现有抗真菌药物的杀菌活性，及研发新型针对该基因及其编码蛋白的靶向药物。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种烟曲霉ABC转运蛋白的Af
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ABC基因及其应用。
[0007]本专利技术的技术方案是：一种烟曲霉ABC转运蛋白的Af
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ABC基因，特征在于：所述的烟曲霉Af
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ABC基因的核苷酸序列如序列1所示；其编码蛋白质是1604个氨基酸残基组成如序列2所示。
[0008]所述的一种烟曲霉ABC转运蛋白的Af
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ABC基因能作为靶点在设计靶向药物中应用。
[0009]所述的一种烟曲霉ABC转运蛋白的Af
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ABC基因能在筛选曲霉病治疗药物中应用。
[0010]本专利技术的优点在于：本专利技术采用同源重组的基因敲除方法敲除获得烟曲霉中一种ABC转运蛋白编码基因序列为Af
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ABC的基因敲除株，对研究烟曲霉生长、毒力及对伏立康唑的敏感性，及研发新型针对该基因及其编码蛋白的靶向药物，筛选曲霉病治疗药物具有十分重要的科学意义和
DNA模板（MolPure
®ꢀ
Plasmid Mini Kit），扩增其中的pyrG编码基因片段, 约1.3kb，基因序列由序列表中序列表5所示，跑胶验证并纯化后（同上），于
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20℃储存。扩增条件为：95℃，2min；(95℃，30s；55℃，30s；68℃，1 .5min)35个循环；68℃， 5min。PCR体系为：上游引物 2μl，下游引物 2μl，ddH2O 6μl，DNA 15μl，2
×
HieffPCR
®ꢀ
Master Mix 25μl；4）将上述的3段纯化后产物进行融合PCR。以5'
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taccAACCCTGGACGTCTACTCTCA
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3'作为上游引物和5'
ꢀ‑
atgaGCCCCGAAGTCATTGCGATTA
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3'作为下游引物，三段基因片段PCR融合，如此即可得到敲除盒子，基因序列由序列表中融合后产物序列如序列6所示，融合后产物经跑胶验证，约为4.0kb的基因序列，即为Af
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ABC基因的敲除盒子，进行切胶纯化（MolPure
®ꢀ
Gel Extraction Kit）后于
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20℃储存。扩增条件为：95℃，2min；(95℃，30s；70℃，1s；55℃，30s；72℃，3min50s)35个循环；72℃， 5min。PCR体系为：上游侧翼基因片段 5μl，下游侧翼基因片段 5μl，pyrG片段 5μl，上游引物 2μl，下游引物 2μl，ddH2O 6μl，2
×
Hieff Canace
®ꢀ
Gold PCR Master Mix 25μl；5）上述上游侧翼基因片段和下游侧翼基因片段，pyrG基因片段以及三段融合产物片段经1%琼脂糖凝胶电泳跑胶验证条带长度如附图1至附图3所示。附图 1中，泳道1为GoldBand 5000 DNA Marker，泳道2和泳道3分别为上游侧翼基因片段和下游侧翼基因片段，片段长度均为1.2 kb左右。附图2中，泳道1为GoldBand 5000 DNA Marker，泳道2为pyrG基因片段，片段长度约为2.2kb左右。附图3中，泳道1为GoldBand 5000 DNA Marker，泳道2为三段基因片段融合PCR产物，片段长度约为5.0 kb左右。如此即可验证成功获得敲除盒子。
[0022]实例2：原生质体的构建1）本专利技术中，实验所特需转化用的中间宿主菌株A1160（ΔKU80,pyrG
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）购自（http://www.fgsc.net/asperg.html），该菌是尿嘧啶营养缺陷株,该菌由于缺少基因片段pyrG导致其无法在不含尿嘧啶的察氏固体培养基(CZA青岛海博生物 货号HB0231
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1)上生长，于是专利技术人采用不含尿嘧啶的CZA来进行筛选，成功导入敲除盒子的阳性转化子
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AfABC可在此种培养基中生长。
[0023]2）实验所需配置的溶液简述如下：KCL/C6H8O7
·
H2O溶液：准确称取16.4gKCL，4.2gC6H8O7
·
H2O于烧杯中，加入1700ml去离子蒸馏水，将混合液pH调至5.8后补液去离子蒸馏水定容至2L，高压灭菌，4℃储存。
[0024]原生质溶液：取20mlKCL/C6H8O7
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H2O溶液于烧杯中，加入0.5g复方酶制剂LYSIS ELEVAGE（法国SAS SOFRALAB OENOFRANCE公司 批号83377）、5ml液体果胶酶（夏盛北京生物科技开发有限公司 批号12112105）、1g纤维素酶（夏盛北京生物科技开发有限公司 批号2200837），混合充分后使用一次性经消毒注射器驱动0.22﹣μm PVDF 过滤器过滤至高压灭菌后的250ml烧瓶中。在原生质体使用前30min之内，使之与等体积的沙氏液体培养基（SAB，北京索本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种烟曲霉ABC转运蛋白的Af
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ABC基因，特征在于：所述的烟曲霉Af
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ABC基因的核苷酸序列如序列1所示；其编码蛋白质是1604个氨基酸残基组成如序列2所示。2.根据权利要求1所述的一种烟曲霉ABC转运蛋白的Af
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ABC基因，其特征在于：所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙毅，廖魏祖，熊守信，谭丽华，张恒，
申请(专利权)人：荆州市中心医院长江大学附属荆州医院，
类型：发明
国别省市：