一种用于检测胚胎植入前染色体非整倍体的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测胚胎植入前染色体非整倍体的方法，本发明专利技术使用部分简并寡核苷酸引物进行PCR反应(引物中间含6个随机碱基)，首先使用较低的温度(～25℃)进行退火，随后再缓慢升温至引物延伸温度进行引物延伸，完成最初几个循环后，再使用较高的退火温度(～55℃)进行多循环常规PCR反应，从而实现对全基因组的扩增，本发明专利技术操作简单，人为接入的步骤相对MALBAC少，同时DNA产物的产量较高，引入了通过覆盖深度的方法来检测拷贝数变异，同时不对数据进行过滤和清洗，使用高斯混合模型下训练数据，利用低质量的数据进行信息分箱，提高分析结果的准确性，不仅数据利用率高，显著降低检测成本，同时相比传染分析方法其准确度更高。高。高。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测胚胎植入前染色体非整倍体的方法


[0001]本专利技术涉及辅助生殖
，具体是一种用于检测胚胎植入前染色体非整倍体的方法。

技术介绍

[0002]胚胎植入前染色体非整倍体检测是指采用胚胎细胞进行的低深度全基因组的高通量测序法，通过对获取的单个或有限的胚胎细胞的全基因组扩增产物进行全基因组高通量大规模并行基因组测序，并将全基因组测序结果进行统计学信息分析，从而判断胚胎的染色体是否为非整倍体，或是否含有拷贝数变异(CNV，Copy Number Variants)的片段，正常胚胎的染色体是整倍体即二倍体，非整倍体胚胎通常容易导致流产或者胎儿异常(发育问题或者疾病)，因此医院在对患者进行辅助生殖时需要对胚胎植入前染色体非整倍体进行检测。
[0003]由于胚胎植入前检测只能取少量约1
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3个细胞，而每个胚胎细胞含有的一整套人的全基因组DNA含量约6.6pg，需要对对极微量的DNA进行全基因组扩增，才能进行接下来的检测，目前广泛用于胚胎植入前染色体非整倍体检测的方法主要是基于MALBAC(Multiple Ann本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测胚胎植入前染色体非整倍体的方法，其特征在于：其方法包括以下步骤，S1：全基因扩增，全基因扩增包括细胞裂解、预扩增和扩增；A.细胞裂解此阶段需要的试剂：细胞裂解缓冲液、细胞裂解酶、TE Buffer。1)配制裂解体系：在离心管中依次加入以下试剂，轻轻涡旋混合，短暂离心，并放入冰盒待使用；2)准备样本：从
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80℃冰箱中取出细胞样本后，立即置于冰盒上，短暂离心大约5秒，立即放回冰盒上,同时用2.5μL TE Buffer作为扩增的空白对照；向所有的样本加入TE Buffer，补足至5.0μL，瞬时离心，置于冰盒上；3)向样本管中分别加入第一步制备的裂解体系5.0μL，请勿振荡，轻微地瞬时离心即可；4)设置PCR仪反应程序(热盖保持105℃)；B.预扩增此阶段需要的试剂：预扩增缓冲液、预扩增酶；室温融化后充分振荡混匀，瞬时离心。1)制备全基因组预扩增反应体系，轻轻涡旋混合，短暂离心，并放入冰盒待使用；2)从PCR仪中取出细胞裂解反应结束的样本，置于冰盒上，向每管样本中加入上一步制备的全基因组预扩增反应体系10.0μL，请勿振荡，轻微地瞬时离心即可；3)设置PCR仪反应程序(热盖保持105℃)；C.扩增预先取出扩增试剂和标签列(GCTCTTCCGATCTKKKKKKNNTGGG；GCTCTTCCGATCTKKKKKKNNGTTT)，室温融化后充分振荡混匀，瞬时离心；1)准备扩增反应体系，轻轻涡旋混合，短暂离心，并放入冰盒待使用；2)在预扩增产物PCR管中加入20.0μL扩增反应体系；3)设置PCR仪反应程序(热盖保持105℃)；S2：文库纯化；1)现配适量的80％乙醇；2)使用前将纯化磁珠平衡至室温至少30min；3)向每个样品中加入等体积的磁珠50μL，轻轻涡旋混合均匀；4)将混合物在室温下孵育5min；5)瞬时离心，置于磁力架上2min，小心丢弃上清；6)向每个样本缓慢加入200μL现配的80％乙醇，于磁力架上孵育静止30s；然后小心地丢弃上清液，注意不要吸到或扰乱磁珠；7)重复步骤6)，共两次乙醇洗涤；8)瞬时离心，将剩余管壁液体离心至管底；9)在磁力架上孵育2min，然后小心地吸弃上清，敞开管盖，室温晾至磁珠表面无泛光；10)用40μL无核酸酶水重悬磁珠，将重悬混合物在室温下孵育2min；11)于磁力架上静置2min，转移38μL上清至新的1.5mLEP管，纯化后文库样品可保存在
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20℃，1个月内可用于上机测序，冻融次数不超过3次。
S3：文库定量；1)纯化后的文库使用Qubit荧光计进行文库定量：单个文库浓度应大于25ng/μL；2)Qsep100生物片段分析仪检测片段长度，文库片段为600～1000bp。S4：混合文库制备；文库混合：根据Qubit的定量结果，每个样本取等质量文库进行混合，若有空白对照，则空白对照混合量为样本取样体积的平均值。S5：接头转换及文库变性；使用“MGIEasy通用文库转换试剂盒”，严格按照说明书操作。S6：DNB制备及测序；使用测序反应通用试剂盒(联合探针锚定聚合测序法)于基因测序仪(MGISEQ
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200)上进行测序反应，严格按照说明书操作。S7：数据分析；使用胚胎染色体异倍体分析系统，进行数据分析，严格按照说明书操作。1)统计质控信息2)GC校正3)标准化4)循环二进制切割(Circular binary segmentation，简称CBS)常染色体CBS使用R包DNAcopy进行分析，其中参数α(检测断点的P
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value)设定为1e
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5，每个segment至少包含两个bins，最后连续bins的平均值作为这个segement的ratio，循环二进制切割能够提高运行速度和检测效果，用阴性样本库中的突变信息对CBS和区段z
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score进行权重分析，通过这个方法可以对不太精确的bins降低权值。5)黑名单过滤无信息位点人类基因组中存在大量充满问题的重复区，如微卫星、中心粒、端粒会妨碍短序列比对的正确性，这些位点会使得数据标准化变得非常复杂，因此需要建立黑名单，将这些区域进行标记过滤，以提高分析的...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡晶晶，李彩娜，崔茜，
申请(专利权)人：上海品峰医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：