MODY类型糖尿病基因检测引物和方法技术

本发明专利技术公开了一种MODY类型糖尿病基因检测引物和方法，具体是基于基因多重PCR靶向富集结合高通量测序技术测定成人型糖尿病易感基因全部外显子序列以及外显子内含子拼接区突变的引物。经过本发明专利技术的提供的检测引物和检测方法，通过判断突变位点即可辅助了解青少年糖尿病的遗传因素背景，为临床上患者的个体化治疗、预后判断和预防干预提供便利。预后判断和预防干预提供便利。预后判断和预防干预提供便利。

【技术实现步骤摘要】
MODY类型糖尿病基因检测引物和方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种基于基因多重PCR靶向富集结合高通量测序技术测定成人型糖尿病易感基因的检测引物、试剂盒和方法。

技术介绍

[0002]随着我国经济的快速发展和人民生活方式的改变，与肥胖密切相关的T2DM的低龄化倾向也在日渐明显。特殊类型的糖尿病中，以青少年起病的成人型糖尿病(maturity onset diabetes of the young，MODY)最受关注。MODY是一种常染色体显性遗传的单基因遗传病，主要是由于胰岛β细胞葡萄糖刺激下的胰岛素分泌功能障碍所致，通常于青春期及青年期发病。在欧洲，MODY的发病率占总糖尿病人群的1％～2％，在18
‑
45岁的人群中，发病率为百万分之108。
[0003]在特殊类型糖尿病中，MODY发病率相对较高，且有明确的遗传规律，因此研究MODY具有重要意义。首先，MODY的诊断有助于设计更个体化的治疗方案。例如，MODY2患者大多不需要药物治疗，仅通过饮食和运动即可良好控制血糖；而MODY3患者则对较小剂量磺脲类药物治疗敏感。其次，MODY的正确诊断有助于判断患者预后，例如，MODY2患者虽然高血糖持续存在，在随后的数年中血糖无持续增高趋势，且长期随访慢性并发症少见，预后良好。这将极大减轻患者的心理和经济负担；而MODY3患者血糖随着病程延长而增高，β细胞功能呈进行性降低，可出现各种慢性并发症，特别是微血管并发症，尤以视网膜和肾脏病变最为常见。明确的分子遗传学诊断可为MODY患者及其亲属提供遗传学指导。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种基于基因多重PCR靶向富集结合高通量测序技术测定成人型糖尿病易感基因的检测引物、试剂盒和方法。
[0005]本专利技术的一个方面，提供一种引物组合。所述引物组合中，任一引物的扩增片段选自单基因糖尿病致病基因中至少一个基因中的至少一段序列。
[0006]优选地，所述因糖尿病致病基因包括KLF11、NEUROD1、GCK、PAX4、BLK、CEL、INS、KCNJ11、ABCC8、HNF1A、PDX1、HNF1B、HNF4A、
[0007]可选地，所述引物组合选自针对所述糖尿病致病基因设计的序列如表1所示，或与表1所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列的引物。
[0008]本专利技术重点根据KLF11、ABCC8、HNF1A、PAX4设计检测引物。引物序列如下表1：
[0009][0010][0011][0012][0013]根据本专利技术的又一方面，提供一种基于基因多重PCR靶向富集结合高通量测序技术测定成人型糖尿病易感基因突变的方法，包括下列步骤：
[0014](1)低温提取新鲜外周血DNA；(2)通过预设PCR产物扩增待测基因；(3)高通量测序技术确定基因突变位点；(4)分析该突变位点是否为致病突变；(5)经审核后出具基因检测报告。
[0015]所述步骤(2)扩增待测基因用的序列如表1所示，或与表1所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列的引物。
[0016]本专利技术的又一方面，提供一种试剂盒，具体是一种基于基因多重PCR靶向富集结合高通量测序技术测定成人型糖尿病易感基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括DNA提取试剂、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液和dNTP混合物和表1所述的引物，或或与表1所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列的引物。
[0017]本专利技术的有益效果
[0018]本专利技术提供了一种MODY型糖尿病基因检测引物、检测方法和试剂盒，经过本专利技术的检测，通过判断突变位点即可辅助了解青少年糖尿病的遗传因素背景，为临床上患者的个体化治疗、预后判断和预防干预提供便利。
附图说明
[0019]图1
‑
图9是本专利技术实施例中患者的基因检测结果。
具体实施方式
[0020]实施例1下面结合实施例详述本申请、但本申请并不局限于这些实施例。
[0021]如无特殊说明，下述实施例中所使用的实验方法，均为常规方法。下述实施例中所用原料和试剂均来自商业购买、未经处理直接使用、所用仪器设备采用厂家推荐的方案和参数。
[0022]对从医院或其他研究机构获得的血样、唾液或其他组织样本，利用DNA提取试剂盒提取全基因组DNA，并用核酸定量仪对提取的DNA进行浓度测定，DNA浓度为浓度50ng/ul，总量不低于200ng。
[0023]本实施例基于基因多重PCR靶向富集结合高通量测序技术测定成人型糖尿病易感基因突变的方法，包括下列步骤：
[0024](1)低温提取新鲜外周血DNA；(2)通过预设PCR产物扩增待测基因；(3)高通量测序技术确定基因突变位点；(4)分析该突变位点是否为致病突变；(5)经审核后出具基因检测报告。
[0025]所述步骤(2)扩增待测基因用的序列如表1所示。
[0026]具体的，多重扩增实验的实验基本流程如下:
[0027]基因组定量、多重扩增、PCR产物纯化回收、通用引物扩增、终产物纯化、实验环境准备
[0028][0029][0030]Step 1：基因组定量
[0031]采用dsDNA HS Assay Kit或荧光定量PCR对基因组进行定量。
[0032]基本要求：
[0033]1.最低5ng/ul DNA 10ul。
[0034]2.建议20ng/ul以上DNA 10ul。
[0035]Step 2：靶区域扩增用时大约1小时30分钟
[0036]事先准备：
[0037]1.Primer A/B mix提前10分钟从冰箱取出解冻；
[0038]2.如有大量样本，请提前配置反应mix后分液。
[0039]原则上本多重扩增方式仅需20ngDNA即可完成反应。通常情况下，基因组足够，建议尽可能
[0040]加大DNA至50
‑
200ng，能得到最佳的扩增效果。
[0041]若为唾液、口腔粘膜、粪便等不确定人基因组纯含量的样本，加大投入量。
[0042]A.扩增体系
[0043]采用0.2ml PCR管/96PCR板，在超净台里按照如下体系配置反应：
[0044][0045]B.扩增程序设置
[0046][0047]*如DNA投入量为10ng,适当增加2循环
[0048]Step 3：PCR产物纯化用时约20分钟
[0049]具体步骤如下：
[0050]1.向PCR反应液/酶促反应液加入0.5倍体积AMPure XP Beads(30ul体系加15ul),
用移液器50ul量程上下吹打10
‑
15次，以使扩增产物与AMPure XP Beads充分混匀。室温静置1
‑
2分钟。
[0051]2.用强力磁铁或磁力架吸附磁珠本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于基因多重PCR靶向富集结合高通量测序技术测定成人型糖尿病易感基因全部外显子序列以及外显子内含子拼接区突变的引物，其特征在于，引物序列如表1所示。2.基于基因多重PCR靶向富集结合高通量测序技术测定成人型糖尿病易感基因突变的方法，其特征在于，包括下列步骤：（1）低温提取新鲜外周血DNA；（2）通过预设PCR产物扩增待测基因；（3）高通量测序技术确定基因突变位点；（4）分析该突变位点是否为致病突变；（5）经审核后出具基因检测报告。3.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘元涛，张玉超，马小莉，公茂莲，赵蕙琛，
申请(专利权)人：青岛市市立医院，
类型：发明
国别省市：