一种生物气溶胶发生用标准物质及其制备方法与定值方法技术

本发明专利技术公开了一种生物气溶胶发生用标准物质及其制备方法与定值方法。本发明专利技术标准物质，包括细菌菌体和菌体冻干保护剂的冻干物；所述菌体冻干保护剂的冻干物包括蔗糖、谷氨酸钠、PEG8000、PVP。本发明专利技术标准物质的制备方法，包括如下步骤：1)用无菌生理盐水将所述细菌菌体稀释到109级，成菌悬液状；所述菌体冻干保护剂的冻干物用磷酸盐缓冲液溶解成所述菌体冻干保护剂；2)所述菌悬液状与所述冻干保护剂进行混合，然后在

【技术实现步骤摘要】
一种生物气溶胶发生用标准物质及其制备方法与定值方法


[0001]本专利技术涉及一种生物气溶胶发生用标准物质及其制备方法与定值方法。

技术介绍

[0002]近些年，关于气溶胶感染的报道屡见不鲜，通过气溶胶传播的细菌包括鼠疫、炭疽等致病微生物，其致死率高，对社会危害极大。同时，气溶胶监测的技术发展迅猛，各种气溶胶监测的设备层出不穷，如何评价其监测的有效性，成为亟待解决的问题。气溶胶模拟试验是目前公认的可以用来测试仪器的性能，验证消毒剂及器械的消杀效率和质量的方法。根据卫生部制定的消毒技术规范，用于消毒及灭菌的器械都需要进行模拟试验。将标准物质菌均匀分散到实验舱里，用采样设备采样记录生长菌落数，进行试验对照。3次同条件试验结果的杀灭率≥99.90％，可认为消杀合格。
[0003]病原微生物感染严重威胁人类健康。微生物标准物质的研究与研制较少，此类标准物质匮乏。直至2018年国家标准物质库才出现了细菌相关的一级标准物质。近几年对于食品安全领域的常见食品微生物研究和研制较多，例如单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等。
[0004]对于气溶胶模拟实验相关的标准物质研究较少。现在常用的气溶胶发生物质为粉尘、聚苯乙烯微球等模拟微生物的粒径，却不具有微生物真正的生物活性，从而使得其结果与真实的微生物气溶胶发生不同，并且不能通过监测生物荧光本底来进行定量。
[0005]冷冻干燥法是长期稳定保存微生物菌株的有效方法之一，针对各类菌株的生存条件差异，冻干保护剂不尽相同。糖类(蔗糖、海藻糖、乳糖)、氨基酸类、脱脂乳、明胶等是用的比较多的冻干保护剂成分。已有对于冻干保护剂的研究中，其与细菌混合后保存时间可以达到6个月，12个月甚至18个月，细菌存活率基本可维持在70％以上，甚至可以达到90％以上。
[0006]针对实验室安全保障和仪器效率类的细菌标准物质研究较少且售卖有限，为满足实验室检测需要，研制稳定性良好的细菌标准物质是有必要的。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种生物气溶胶发生用标准物质及其制备方法与定值方法。本专利技术标准物质具有良好的均匀性，复水性和稳定性，标准物质可用于空气微生物监测的各种模拟气溶胶实验，其中活菌定值和总菌的定值可用于微生物采样器的微生物存活率的计算；颗粒总量定值可用于微生物采样器的采样效率计算。
[0008]本专利技术提供了一种生物气溶胶发生用标准物质，包括细菌菌体和菌体冻干保护剂的冻干物；
[0009]所述菌体冻干保护剂的冻干物包括蔗糖、谷氨酸钠、PEG8000和PVP。
[0010]本专利技术所述生物气溶胶发生用标准物质具有生物活性与颗粒特性，用于活体细菌定值、总菌定值或总颗粒定值。
[0011]上述的标准物质中，所述细菌菌体选自革兰氏阳性菌、革兰氏阳性菌芽孢、革兰氏阴性菌中的至少一种。
[0012]上述的标准物质中，所述革兰氏阳性菌选自白色葡萄球菌；
[0013]所述革兰氏阳性菌芽孢选自萎缩芽胞杆菌；
[0014]所述革兰氏阴性菌选自大肠埃希氏菌或粘质沙雷氏菌；
[0015]上述的标准物质中，所述细菌标准物质由纯水复水后，菌液浓度不低于1
×
108CFU/mL；
[0016]所述标准物质还包括磷酸盐缓冲液，用于将所述菌体冻干保护剂的冻干物溶解为所述菌体冻干保护剂。
[0017]上述的标准物质中，所述冻干物优选为饼状或球状。
[0018]上述的标准物质中，所述菌体冻干保护剂包括如下质量份的组份：
[0019]蔗糖1～4份；谷氨酸钠1～10份；PEG8000 1～3份；PVP 0.5～1份；溶剂为磷酸盐缓冲液。
[0020]本专利技术还提供了一种上述的标准物质的制备方法，包括如下步骤：1)用无菌生理盐水将所述细菌菌体稀释到109级，成菌悬液状；
[0021]所述菌体冻干保护剂的冻干物用磷酸盐缓冲液溶解成所述菌体冻干保护剂；
[0022]2)所述菌悬液状与所述菌体冻干保护剂进行混合，然后在
‑
80～
‑
60℃预冻4h～8h后冻干，即得到所述标准物质。
[0023]上述的制备方法中，步骤1)中，所述生理盐水的质量百分浓度为0.85％；
[0024]步骤2)中，所述菌悬液状与所述冻干保护剂溶液混合的体积比可为1：10～20。
[0025]上述的制备方法中，步骤2)中，所述冻干的条件如下：冷阱
‑
50℃，冻干温度
‑
40℃，隔板最终温度25℃，冻干压力0.037mbar。
[0026]上述的制备方法中，当所述细菌菌体选自革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌时，培养方法如下：挑取单克隆菌落于灭菌的LB培养基中，培养方案是37
±
1℃下，1200rpm摇床培养12h；
[0027]当所述细菌菌体为选自革兰氏阳性菌芽孢，所述芽孢的培养方法如下：将液体菌液接种到罗氏瓶固体培养基中培养芽孢，选择芽孢培养基为胰蛋白胨、酵母粉、NaCl、KCl、MgSO4、Ca(NO3)、MnCl2、FeSO4、琼脂粉，培养7～10天，然后染色，显微镜观察芽孢比例大于90％时用L棒刮取菌液收集，收集菌落用0.85％生理盐水保存。
[0028]本专利技术中，制备得到标准物质于
‑
20℃保存，稳定性大于6个月。
[0029]本专利技术进一步提供了一种上述的标准物质的定值方法，
[0030]当用于活体细菌定值时，包括如下(1)
‑
(3)的步骤：
[0031](1)用纯水复水溶解所述气溶胶发生用标准物质，复水后充分混匀定为S0溶液；
[0032](2)用0.85％的生理盐水对所述S0溶液进行10倍列稀释，根据估算浓度选取三个稀释度在LB培养基的平板中进行平板涂布，涂布后静置10min，然后放于37℃
±
2℃培养12h以上；
[0033](3)选择步骤(2)中菌落数在3CFU～300CFU之间的平板，菌落计数以菌落形成单位CFU表示，实验结果以活菌浓度表示，计数该稀释度平板上的典型菌落，按照如下式Ⅰ计算标准值，即为所述活体细菌的定值；活体菌定值结果表示为：所述活体细菌标准值
±
拓展不确
定度；
[0034]式Ⅰ：
[0035]式Ⅰ中，
[0036]C为菌落浓度，CFU/mL；
[0037]N为平板上典型菌落的总数，CFU；
[0038]d为稀释因子，无量纲；
[0039]v为平板上菌液接种体积，单位mL；
[0040]当用于总菌定值时，包括如下(4)
‑
(6)的步骤：
[0041](4)用纯水复水溶解所述气溶胶发生用标准物质，复水后充分混匀定为S0溶液；
[0042](5)通过核酸取试剂盒提取S0溶液的总核酸；
[0043](6)通过微量分光光度计测量所述总核本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物气溶胶发生用标准物质，其特征在于，包括细菌菌体和菌体冻干保护剂的冻干物；所述菌体冻干保护剂的冻干物包括蔗糖、谷氨酸钠、PEG8000和PVP。2.根据权利要求1所述的标准物质，其特征在于，所述细菌菌体选自革兰氏阳性菌、革兰氏阳性菌芽孢、革兰氏阴性菌中的至少一种。3.根据权利要求1或2所述的标准物质，其特征在于，所述标准物质由纯水复水后，菌液浓度不低于1
×
108CFU/mL；所述标准物质还包括磷酸盐缓冲液，用于将所述菌体冻干保护剂的冻干物溶解为菌体冻干保护剂。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的标准物质，其特征在于，所述冻干物优选为饼状或球状；所述菌体冻干保护剂包括如下质量体积百分比，单位以g/100ml计：蔗糖1％～4％；谷氨酸钠1％～10％；PEG8000 1％～3％；PVP 0.5％～1％；溶剂为磷酸盐缓冲液。5.一种权利要求1
‑
4中任一项所述的气溶胶发生用标准物质的制备方法，包括如下步骤：1)用无菌生理盐水将所述细菌菌体稀释到109级，成菌悬液状；所述菌体冻干保护剂的冻干物用磷酸盐缓冲液溶解成所述菌体冻干保护剂；2)所述菌悬液状与所述冻干保护剂进行混合，然后在
‑
80～
‑
60℃预冻4h～8h后冻干，即得到所述气溶胶发生用标准物质。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述生理盐水的质量百分浓度为0.85％；步骤2)中，所述菌悬液状与所述冻干保护剂溶液混合的体积比为1：10～20。7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述冻干的条件如下：冷阱
‑
50℃，冻干温度
‑
40℃，隔板最终温度25℃，冻干压力0.037mbar。8.根据权利要求5
‑
7中任一项所述的制备方法，其特征在于，当所述细菌菌体选自革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌时，培养方法如下：挑取单克隆菌落于灭菌的LB培养基中，培养方案是37
±
1℃下，1200rpm摇床培养12h；当所述细菌菌体选自革兰氏阳性菌芽孢，所述芽孢的培养方法如下：将液体菌液接种到罗氏瓶固体培养基中培养芽孢，选择芽...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘旭，周蕾，胡秋实，田胜男，陈婷婷，程方圆，谢晴晴，高娟，
申请(专利权)人：张家港长三角生物安全研究中心，
类型：发明
国别省市：