一种联合抗生素特异性筛选嗜黏蛋白阿克曼氏菌的方法技术

本发明专利技术公开一种联合抗生素特异性筛选嗜黏蛋白阿克曼氏菌的方法，属于微生物技术领域，所述的联合抗生素包括万古霉素、庆大霉素、卡那霉素，所述的筛选培养基是以脑心浸液肉汤培养基（Brain Heart Infusion，简称BHI）为基础进行改良的培养基，本发明专利技术的联合抗生素改良培养基能同时抑制粪便样品中的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，但不抑制Akk菌的正常生长，使得其在平板表面良好生长，降低了复杂混合样品中Akk菌的筛选难度，有助于Akk菌的筛选培养。有助于Akk菌的筛选培养。有助于Akk菌的筛选培养。

【技术实现步骤摘要】
一种联合抗生素特异性筛选嗜黏蛋白阿克曼氏菌的方法


[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及一种联合抗生素特异性筛选嗜黏蛋白阿克曼氏菌的方法。

技术介绍

[0002]嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila，Akk菌)存在于人体肠道内，作为人体肠道的常驻民，占人体微生物群落的3～5％，其标准菌株MucT于2004年由Derrien分离，为卵圆形，革兰阴性的厌氧菌，是疣微菌门的代表。Akk菌是一种粘蛋白分解细菌，将黏蛋白作为碳、氮元素和能量的唯一来源，即利用位于肠上皮的杯状细胞所分泌的黏蛋白“为食”，从而促进肠上皮干细胞的增殖，维持肠屏障功能完整性。近年来大量的人类和动物研究已经解决了Akk菌丰度与各种疾病的关系问题。Akk菌丰度被认为与代谢紊乱以及炎症性疾病呈负相关，包括肥胖、II型糖尿病、炎症性肠病(IBD)、渐冻症、癫痫、孤独症和特异反应性等。
[0003]Akk菌最初由荷兰瓦格宁根大学的Derrien分离得到，国内的南方医科大学彭永正教授团队依靠Derrien团队的方法从中国南方人群中分离到22株Akk菌。江南大学翟齐啸教授团队通过改进Derrien团队的方法，专利技术了一种Akk菌特异性筛选培养基，可使Akk菌筛选的阳性率高达70％。这三个团队的方法都是先采用只含有纯化的猪胃黏蛋白的富集培养基进行富集培养，然后再选择出现浑浊度最低的富集培养液进行分离培养，其中会涉及到配制添加碱性溶液、酸性溶液、无机盐溶液，纯化黏蛋白等步骤，不仅实验步骤繁琐，还存在一些试剂稀有、价格昂贵等的问题，不利于实验室中快速准确地筛选分离Akk菌。另有吉林大学杨勇军教授团队采用万古霉素固体培养基的方法从健康小鼠粪便中筛选分离到两株Akk菌，其平板分离法简化了Akk菌筛选分离的步骤，但专利技术人在具体实施时，发现在万古霉素固体培养基上面生长出很多杂菌，其中以产臭菌株为主，很难从这些菌株中筛选出Akk菌。分析发现万古霉素只能抑制革兰氏阳性菌，对于不是Akk菌的革兰氏阴性菌并无抑制效果，因此能够抑制这些革兰氏阴性菌，且不抑制Akk菌的抗生素目前还未见报道。
[0004]中国专利号CN201910721005.6公开了一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌的厌氧培养方法，所述的培养基为改良BHI培养基中添加Mucin和Yeast Exctact，能使Akk菌在平板表面生长，且使得Akk菌的生长速度由使用普通黏蛋白培养基(BHI+黏蛋白)的3～4d降为24～36h，极大的缩短了培养时间，符合快速分离筛选的要求。因为该方法能使Akk菌快速生长，所以本专利技术中涉及到的改良BHI培养基是参考该专利方法，实际实施时只要能够培养Akk菌的培养基都能采用，比如能培养Akk菌的合成培养基，其中Akk菌的生长速率则由培养基的特性决定。所以为了提高筛选成功率，将联合抗生素与改良BHI培养基相结合，专利技术一种特异性筛选Akk菌的方法，使得本领域技术人员能够快速准确地筛选到Akk菌，以便进行深入研究。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的上述缺点，本专利技术提供了一种联合抗生素特异性筛选嗜黏蛋
CO2。
[0021]采用本专利技术的技术方案，具有如下有益效果：
[0022]1、本专利技术的联合抗生素特异性筛选方法能够有效抑制粪便样品中的杂菌，其中万古霉素抑制革兰氏阳性菌，庆大霉素抑制革兰氏阴性菌及一些万古霉素无法抑制的革兰氏阳性菌，卡那霉素同时抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，三种抗生素的联合使用形成有效的互补作用，降低了粪便样品中Akk菌筛选分离的难度。
[0023]2、采用本专利技术的筛选培养方法，可以使得不需采用含有黏蛋白的富集培养基对粪便样品进行富集培养，而可以直接将粪便样品进行梯度稀释，然后进行平板稀释涂布，在固体培养基的表面就能形成典型的菌落形态，便于挑选菌落进行分离鉴定，具有快速准确、操作简单的特点，适用于Akk菌的特异性筛选。
附图说明
[0024]此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：
[0025]图1是同一粪便样品在有无抗生素组合下的平板筛选图；其中，A图为含抗生素筛选平板，B图为不含抗生素筛选平板；
[0026]图2是本专利技术所分离的Akk菌落形态图；其中，A图为菌液稀释涂布，B图为菌落平板划线；
[0027]图3是本专利技术所分离的Akk菌的1000倍普通光学电子显微镜下的革兰氏染色图；
[0028]图4是本专利技术实施例2中所分离的Akk菌PCR扩增分子鉴定条带图；其中，电泳道从左至右分别是分子量为500bp的Maker，平板上面挑选的疑似菌落1～8，空白对照CK；
具体实施方式
[0029]下面将结合本专利技术中的附图，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0030]下面实施例中的万古霉素、庆大霉素和卡那霉素购买自Solarbio；黏蛋白购自Sigma公司；脑心浸液肉汤(BHI)购自青岛海博生物技术有限公司；酵母浸粉、L
‑
半胱氨酸盐酸盐、碳酸氢钠、大豆蛋白胨、N
‑
乙酰葡萄糖胺购置北京澳博星生物技术有限公司；粪便来自广西壮族自治区河池市某县的长寿老人。
[0031]实施例1
[0032]联合抗生素改良BHI培养基的配置
[0033]虽然中国专利号CN201910721005.6公开了一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌的厌氧培养方法，但是其Mucin溶液使用方法不准确，缺少黏蛋白纯化的步骤，使得该Mucin溶液即使高压蒸汽灭菌都难以消灭干扰物质，往往导致改良BHI液体培养基在添加该Mucin溶液(两者都经过高压蒸汽灭菌)后，由一开始的澄清状态变为浑浊状态(该现象将严重影响后续的分离培养效果)，故培养基的浑浊使得筛选培养试验严重受阻，因此，需先对Mucin溶液进行纯化，然后灭菌，再添加到改良BHI培养基中。
[0034]1、抗生素溶液的配制：将万古霉素溶于无菌超纯水，配制成6ug/mL的母液，将庆大霉素溶于无菌超纯水，配制成10ug/mL的母液，将卡那霉素溶解于无菌超纯水，配制成12ug/mL的母液，过滤除菌放置4℃冰箱备用；
[0035]2、黏蛋白溶液的配制及纯化：将黏蛋白溶于PH＝7.4的PBS缓冲液，浓度为1％(W/V)，室温下，磁力搅拌2h，待其充分溶解后再以8000rpm离心15min，取上清，也冷至0～2℃，得到上清液。在上清液中加入预冷至4℃的乙醇，至乙醇终浓度为60％，轻轻颠倒混匀，4℃静置2h后弃去上清，用蒸馏水重新溶解沉淀至其纯化前的体积，121℃高压蒸汽灭菌20min，待其降温后分装至50mL无菌离心管中，放置
‑
20℃冰箱中，备用；
[0036]3、刃天青的配制本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种联合抗生素特异性筛选嗜黏蛋白阿克曼氏菌的方法，其特征在于，所述的联合抗生素为万古霉素、庆大霉素、卡那霉素，所述的联合抗生素配方为6ug/ml万古霉素、10ug/ml庆大霉素、12ug/ml庆大霉素，所述的筛选方法采用的培养基为改良BHI培养基，所述的改良BHI培养基配方为脑心浸液肉汤38.5g/L、酵母提取物5g/L、黏蛋白2.5g/L、刃天青1mg/L、L
‑
半胱氨酸0.5g/L、碳酸氢钠0.294g/L。2.如权利要求1所述的联合抗生素特异性筛选嗜黏蛋白阿克曼氏菌的方法，其特征在于，所述的联合抗生素改良BHI培养基的配制方法如下：S1：抗生素溶液的配制：将万古霉素溶于无菌超纯水，配制成6ug/mL的母液，将庆大霉素溶于无菌超纯水，配制成10ug/mL的母液，将卡那霉素溶解于无菌超纯水，配制成12ug/mL的母液，过滤除菌放置4℃冰箱备用；S2：黏蛋白溶液的配制及纯化：将黏蛋白溶于PH＝7.4的PBS缓冲液，浓度为1％(W/V)，室温下，磁力搅拌2h，待其充分溶解后再以8000rpm离心15min，取上清，冷却至0～2℃，得到上清液；在上清液中加入预冷至4℃的乙醇，至乙醇终浓度为60％，轻轻颠倒混匀，4℃静置2h后弃去上清，用蒸馏水重新溶解沉淀至其纯化前的体积，121℃高压蒸汽灭菌20min，待其降温后分装至50mL无菌离心管中，放置
‑
20℃冰箱中，备用；S3：刃天青的配制：将刃天青溶解于蒸馏水，得到0.005％(W/V)的刃天青母...

【专利技术属性】
技术研发人员：李全阳，张钦任，周玉盼，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：