一种鸡腿菇纤溶酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种鸡腿菇纤溶酶及其制备方法和应用，涉及生物工程技术领域。本发明专利技术所述鸡腿菇纤溶酶，是以鸡腿菇菌株YY

【技术实现步骤摘要】
一种鸡腿菇纤溶酶及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种鸡腿菇纤溶酶及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]血栓栓塞性疾病已成为影响人类健康的第一大杀手，发病率和致死率逐年升高，其成因主要是由于纤溶系统异常导致纤维蛋白原在凝血酶的作用下形成纤维蛋白并在血管内沉积形成血栓，是导致人类死亡的主要原因之一。溶栓疗法是目前治疗和预防血栓性疾病的主要手段，当前使用的溶栓类产品如蚓激酶、尿激酶、组织型纤溶酶原激活剂等虽疗效肯定，但还存在诸如特异性差、半衰期短、价格昂贵等缺点，因此，研制安全可靠、副作用小的溶栓剂是当前的迫切需要，天然生物资源是新型溶栓剂开发的重要资源。
[0003]鸡腿菇(Coprinus comatus)学名毛头鬼伞，属真菌门，层菌纲伞菌目，鬼伞科，鬼伞属。鸡腿菇味道鲜美，营养丰富，蛋白质含量高，富含包括人体8种必需氨基酸在内的20种氨基酸及多种生物活性因子，有益胃、清神、助消化、增食欲等功效，已被联合国粮农组织和世界卫生组织确定为集“天然、营养、保健”功能为一体的珍稀食用菌之一。研究发现其具有抗氧化、降血糖、防止肝损伤、抗肿瘤、提高免疫力、抑菌等功效，是传统的药食同源真菌，具有重要的医用价值。但目前对鸡腿菇的开发不足，功能因子挖掘不充分，因此，鸡腿菇是一种亟待开发的重要生物资源。
[0004]近十余年时间，专利技术人团队一直致力于微生物源纤溶酶的制备、分离纯化及其功能性研究，突破性的从蛹虫草、好食脉孢菌、茶树菇中分离出5种新纤溶酶，授权了相关专利技术专利5项，其授权号分别为ZL201510159992.7、ZL201010204473.5、ZL200910072630.9、ZL200810137564.4、ZL201910822101.X，其中前4种纤溶酶是通过真菌发酵方式制得，第5种纤溶酶为从子实体中分离得到。然而值得注意的是，国内外相关研究中还未有关于从鸡腿菇中提取纤溶酶的报道。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种鸡腿菇纤溶酶，所述纤溶酶不仅具有很好的溶栓性能，而且使用安全性好，相对分子量小，免疫原性相对较小，易于人体利用，制备成本低廉，具有开发应用的前景。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种鸡腿菇纤溶酶，所述鸡腿菇纤溶酶是单亚基蛋白，所述鸡腿菇纤溶酶的分子量为19.5kDa；所述鸡腿菇纤溶酶N端的9个氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]优选的，所述鸡腿菇纤溶酶由鸡腿菇菌株YY
‑
17制备得到；所述鸡腿菇菌株YY
‑
17的保藏号为CGMCC NO.40393。
[0009]本专利技术提供了上述鸡腿菇纤溶酶的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
[0010]利用鸡腿菇菌株YY
‑
17种子液进行液体发酵培养，得到的发酵液经离心后获得鸡
腿菇纤溶酶的粗酶液；
[0011]将所述粗酶液依次进行盐析、第一次疏水相互作用色谱、凝胶色谱、强阳离子交换色谱、第二次疏水相互作用色谱分离后即可得到所述的鸡腿菇纤溶酶。
[0012]优选的，所述液体发酵的培养基包括如下质量百分含量的成分：果糖1
‑
5％、麸皮0.5
‑
2.5％、豆饼粉1.5
‑
5.5％、NaCl 0.15
‑
0.25％、KH2PO40.15
‑
0.25％、MgSO40.15
‑
0.25％。
[0013]优选的，所述液体发酵的条件为：接种量3
‑
20％，温度20
‑
25℃，时间4
‑
8天。
[0014]优选的，所述盐析的环境温度为3
‑
5℃，所述盐析的时间为10
‑
14h。
[0015]优选的，所述第一次疏水相互作用色谱和第二次疏水相互作用色谱均采用线性洗脱；所述第一次疏水相互作用色谱的起始缓冲溶液为含(NH4)2SO4饱和度为25
‑
35％的0.01
‑
0.03mol/L PBS缓冲溶液，洗脱液为含有0.01
‑
0.03mol/L PBS缓冲溶液，流速为3
‑
5mL/min；所述第二次疏水相互作用色谱的起始缓冲溶液为含(NH4)2SO4饱和度为20
‑
30％的0.01
‑
0.03mol/L PBS缓冲溶液，洗脱液为含有0.01
‑
0.03mol/L PBS缓冲溶液，流速为1
‑
3mL/min。
[0016]优选的，所述凝胶色谱的洗脱液为0.01
‑
0.03mol/L NaH2PO4‑
HCl缓冲溶液；所述NaH2PO4‑
HCl缓冲溶液的pH值为4.0
‑
5.0，流速为5
‑
7mL/min。
[0017]优选的，所述强阳离子交换色谱采用线性洗脱，所述强阳离子交换色谱的起始缓冲溶液为NaH2PO4‑
HCl缓冲溶液，洗脱液为含有0.1
‑
0.2mol/L NaCl的NaH2PO4‑
HCl缓冲溶液；所述NaH2PO4‑
HCl缓冲溶液的浓度为0.01
‑
0.03mol/L，pH为4.0
‑
5.0；所述洗脱的流速为3
‑
5mL/min。
[0018]本专利技术还提供了上述的鸡腿菇纤溶酶或上述制备方法在制备溶栓抗栓食品和/或药物中的应用。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的有益效果：
[0020]本专利技术提供了一种鸡腿菇纤溶酶，是以鸡腿菇菌株YY
‑
17为菌种采用液体发酵得到，所述鸡腿菇纤溶酶最适作用温度为42℃，在人体生理pH时能保存较好的活性；Mn
2+
、Ca
2+
和Zn
2+
对该酶有明显的激活作用，而不同浓度Fe
3+
、Fe
2+
、Al
2+
对鸡腿菇纤溶酶表现出明显的抑制作用。经试验证实可知，本专利技术所述鸡腿菇纤溶酶不但可以直接降解血纤维蛋白，还可以激活纤溶酶原间接降解血纤维蛋白，且可以顺次降解牛血纤维蛋白原的α、β和γ链，表明本专利技术所述鸡腿菇纤溶酶不仅能独立溶栓，还能够激活纤溶酶原间接溶栓，无明显的急性毒性，具有良好的溶栓抗栓效果。
[0021]生物保藏说明
[0022]本专利技术所述的鸡腿菇菌株YY
‑
17，分类学命名：毛头鬼伞Coprinus comatus，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.40393，保藏日期为2023年3月17日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鸡腿菇纤溶酶，其特征在于，所述鸡腿菇纤溶酶是单亚基蛋白，所述鸡腿菇纤溶酶的分子量为19.5kDa；所述鸡腿菇纤溶酶N端的9个氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的鸡腿菇纤溶酶，其特征在于，所述鸡腿菇纤溶酶由鸡腿菇菌株YY
‑
17制备得到；所述鸡腿菇菌株YY
‑
17的保藏号为CGMCCNO.40393。3.权利要求1或2所述鸡腿菇纤溶酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：利用鸡腿菇菌株YY
‑
17种子液进行液体发酵培养，得到的发酵液经离心后获得鸡腿菇纤溶酶的粗酶液；将所述粗酶液依次进行盐析、第一次疏水相互作用色谱、凝胶色谱、强阳离子交换色谱、第二次疏水相互作用色谱分离后即可得到所述的鸡腿菇纤溶酶。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述液体发酵的培养基包括如下质量百分含量的成分：果糖1
‑
5％、麸皮0.5
‑
2.5％、豆饼粉1.5
‑
5.5％、NaCl0.15
‑
0.25％、KH2PO40.15
‑
0.25％、MgSO40.15
‑
0.25％。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述液体发酵的条件为：接种量3
‑
20％，温度20
‑
25℃，时间4
‑
8天。6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述盐析的环境温度为3
‑
5℃，所述盐析的时间为10
‑
14h。7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述第一次疏水相互作用色谱和第二次疏水相互作用色谱均采用线性洗脱；所述第一次疏水相互作用色...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓兰，郑喜群，王今雨，李冠龙，
申请(专利权)人：齐齐哈尔大学，
类型：发明
国别省市：