一种对核酸提取裂解液中异硫氰酸胍耐受时间延长的蛋白酶K突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种对核酸提取裂解液中异硫氰酸胍耐受时间延长的蛋白酶K突变体及其应用。本发明专利技术通过对野生型蛋白酶K进行组合定向改造，在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，将第151位的酪氨酸突变为丙氨酸，第208位的赖氨酸突变为组氨酸，第273的丝氨酸突变为苏氨酸，第293位的甘氨酸突变为丙氨酸。本发明专利技术提供的蛋白酶K突变体相比野生型蛋白酶K更加耐受高浓度的异硫氰酸胍，在25℃下，核酸提取裂解液处理后30分钟时残余活力不受影响；处理60分钟时仍然能保持80％以上残余活力，而此时野生型蛋白酶K残余活力仅为28％。由此提高了蛋白酶K对核酸提取试剂盒的核酸提取裂解液的耐受能力。耐受能力。

【技术实现步骤摘要】
一种对核酸提取裂解液中异硫氰酸胍耐受时间延长的蛋白酶K突变体及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种对核酸提取裂解液中异硫氰酸胍耐受时间延长的蛋白酶K突变体及其应用。

技术介绍

[0002]蛋白酶K是一种来源于林伯氏白色念球菌(Tritirachium album)的丝氨酸蛋白酶，对蛋白质具有高效的切割能力，而且底物谱非常广泛。能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C端邻接的酯键和肽键，常用于降解蛋白产生短肽。蛋白酶K在体外诊断产业、洗涤液、饲料行业以及污水处理等领域均有广泛的应用。在分子诊断领域，蛋白酶K(Proteinase K)是病毒采样液的重要组分，可裂解病毒释放核酸，消除核酸分解酶(RNase)以防止病毒的RNA降解。并且可以灭活病毒，让病毒的蛋白变性，失去活性而“死掉”，不再有传染性，提高运输和检测阶段的安全性。核酸提取过程中，蛋白酶K能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离，在提取高分子量核酸时有很大的优势。蛋白酶K还常被用于降解核酸中的DNA酶和RNA酶。
[0003]在一般情况下，蛋白酶K使用的pH范围是7.5
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9.0之间，在20℃
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60℃摄氏度蛋白酶K都具有活性。蛋白酶K在含有TritX
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100、尿素、SDS、胍盐的环境中仍然能存在且具有一定活性，这一特性也是它广泛应用的原因之一。核酸提取裂解液中通常包含异丙醇和异硫氰酸胍(3mol/L)等成分，野生型蛋白酶K在此环境中虽然具有一定的活性，但是只能维持较短的时间，一般不超过5min，这一缺点给核酸提取过程带来了不稳定的因素，影响了核酸提取的效率。世界各国对用于分子诊断的蛋白酶K需求越来越大，野生型蛋白酶K因为在核酸提取裂解液中不能维持长时间的活性影响了核酸提取过程的稳定性。所以急需筛选出对核酸提取裂解液抗性大幅提高的蛋白酶K。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于针对现有技术的现状及存在的不足，提供一种对核酸提取裂解液中异硫氰酸胍耐受时间延长的蛋白酶K突变体及其应用。本专利技术通过理性设计的方法对野生型蛋白酶K进行定向改造，将蛋白酶K的四个氨基酸位点进行组合定向突变。通过定向突变提高了蛋白酶K对核酸提取试剂盒的核酸提取裂解液的耐受能力。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案施行：
[0006]第一方面，本专利技术提供一种对核酸提取裂解液中异硫氰酸胍耐受时间延长的蛋白酶K突变体，所述蛋白酶K突变体选自如下任一种：
[0007](a)其氨基酸序列由SEQ ID NO.1所示序列突变而来，选自下组的至少两个氨基酸残基位点发生突变：将第151位的酪氨酸突变为丙氨酸，第208位的赖氨酸突变为组氨酸，第273的丝氨酸突变为苏氨酸，第293位的甘氨酸突变为丙氨酸；
[0008]或，
[0009](b)所述蛋白酶K突变体与(a)所述的氨基酸序列具有95％，优选98％，更优选99％的序列相同性，并且具有(a)所述蛋白酶K的功能，其中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的Y151，K208，S273，G293位氨基残基与(a)所述的氨基酸序列中的相同；
[0010]或，
[0011](c)所述蛋白酶K突变体由在(a)所述的氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1
‑
30个，更优选1
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10个，还要优选1
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6个，最优选1
‑
3个氨基酸残基而形成，并且具有(a)所述蛋白酶K突变体的功能，其中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的Y151，K208，S273，G293位与(a)所述的氨基酸序列中的相同。
[0012]根据本专利技术的实施方案，所述突变体的氨基酸序列包含如下位点的突变：对应于SEQ ID NO.1的包含151位、208位、2730位或293位中任意两个位点的氨基酸残基的突变。
[0013]在一个实施方案中，所述突变体的氨基酸序列为如下1)
‑
5)中任一种：
[0014]1)对应于SEQ ID NO.1的第151位的酪氨酸突变为丙氨酸和第208位的赖氨酸突变为组氨酸；
[0015]2)对应于SEQ ID NO.1的第151位的酪氨酸突变为丙氨酸和第273的丝氨酸突变为苏氨酸；
[0016]3)对应于SEQ ID NO.1的第151位的酪氨酸突变为丙氨酸和第293位的甘氨酸突变为丙氨酸；
[0017]4)对应于SEQ ID NO.1的第208位的赖氨酸突变为组氨酸和第273的丝氨酸突变为苏氨酸；
[0018]5)对应于SEQ ID NO.1的第273的丝氨酸突变为苏氨酸和第293位的甘氨酸突变为丙氨酸；
[0019]上述5种突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3
‑
7任一种所示。
[0020]根据本专利技术的实施方案，所述突变体的氨基酸序列包含151位、208位、2730位或293位中任意三个位点的氨基酸残基的突变。
[0021]在一个实施方案中，所述突变体的氨基酸序列为如下1)
‑
4)中任一种：
[0022]1)对应于SEQ ID NO.1的第151位的酪氨酸突变为丙氨酸、第208位的赖氨酸突变为组氨酸和第273的丝氨酸突变为苏氨酸；
[0023]2)对应于SEQ ID NO.1的第151位的酪氨酸突变为丙氨酸、第208位的赖氨酸突变为组氨酸和第293位的甘氨酸突变为丙氨酸；
[0024]3)对应于SEQ ID NO.1的第151位的酪氨酸突变为丙氨酸、第273的丝氨酸突变为苏氨酸和第293位的甘氨酸突变为丙氨酸；
[0025]4)对应于SEQ ID NO.1的第208位的赖氨酸突变为组氨酸、第273的丝氨酸突变为苏氨酸和第293位的甘氨酸突变为丙氨酸；
[0026]上述4种突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8
‑
11任一种所示。
[0027]在优选的实施方式中，所述蛋白酶K突变体是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，将第151位的酪氨酸突变为丙氨酸，第208位的赖氨酸突变为组氨酸，第273的丝氨酸突变为苏氨酸，第293位的甘氨酸突变为丙氨酸，所述蛋白酶K突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
[0028]第二方面，本专利技术提供编码第一方面所述蛋白酶K突变体的多核苷酸，所述多核苷
酸的核苷酸序列可以根据表达系统对密码子的偏好性进行优化。
[0029]在优选的实施方式中，所述氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示蛋白酶K突变体的多核苷酸具有如SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列。
[0030]第三方面，本专利技术提供一种表达载体，所述载体含有第二方面所述的多核苷酸；较佳地，所述表达载体可选：毕赤酵母表达载体pPinkα
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HC，pPIC9K，pPIC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对核酸提取裂解液中异硫氰酸胍耐受时间延长的蛋白酶K突变体，其特征在于，所述蛋白酶K突变体选自如下任一种：(a)其氨基酸序列由SEQ ID NO.1所示序列突变而来，选自下组的至少两个氨基酸残基位点发生突变：将第151位的酪氨酸突变为丙氨酸，第208位的赖氨酸突变为组氨酸，第273的丝氨酸突变为苏氨酸，第293位的甘氨酸突变为丙氨酸；或，(b)所述蛋白酶K突变体与(a)所述的氨基酸序列具有95％，优选98％，更优选99％的序列相同性，并且具有(a)所述蛋白酶K的功能，其中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的Y151，K208，S273，G293位氨基残基与(a)所述的氨基酸序列中的相同；或，(c)所述蛋白酶K突变体由在(a)所述的氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1
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30个，更优选1
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10个，还要优选1
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6个，最优选1
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3个氨基酸残基而形成，并且具有(a)所述蛋白酶K突变体的功能，其中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的Y151，K208，S273，G293位与(a)所述的氨基酸序列中的相同；优选地，所述突变体的氨基酸序列包含如下位点的突变：对应于SEQ ID NO.1的包含151位、208位、2730位或293位中任意两个位点的氨基酸残基的突变；进一步优选地，所述突变体的氨基酸序列包含如下1)
‑
5)中任一种突变位点组合：1)对应于SEQ ID NO.1的第151位的酪氨酸突变为丙氨酸和第208位的赖氨酸突变为组氨酸；2)对应于SEQ ID NO.1的第151位的酪氨酸突变为丙氨酸和第273的丝氨酸突变为苏氨酸；3)对应于SEQ ID NO.1的第151位的酪氨酸突变为丙氨酸和第293位的甘氨酸突变为丙氨酸；4)对应于SEQ ID NO.1的第208位的赖氨酸突变为组氨酸和第273的丝氨酸突变为苏氨酸；5)对应于SEQ ID NO.1的第273的丝氨酸突变为苏氨酸和第293位的甘氨酸突变为丙氨酸；上述5种突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3
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7任一种所示；优选地，所述突变体的氨基酸序列包含如下位点的突变：对应于SEQ ID NO.1的包含151位、208位、2730位或293位中任意三个位点的氨基酸残基的突变。进一步优选地，所述突变体的氨基酸序列包含如下1)
‑
4)中任一种突变位点组合：1)对应于SEQ ID NO.1的第151位的酪氨酸突变为丙氨酸、第208位的赖氨酸突变为组氨酸和第273的丝氨酸突变为苏氨酸；2)对应于SEQ ID NO.1的第151位的酪氨酸突变为丙氨酸、第208位的赖氨酸突变为组氨酸和第293位的甘氨酸突变为丙氨酸；3)对应于SEQ ID NO.1的第151位的酪氨酸突变为丙氨酸、第273的丝氨酸突变为苏氨酸和第293位的甘氨酸突变为丙氨酸；4)对应于SEQ ID NO.1的第208位的赖氨酸突变为组氨酸、第273的丝氨酸突变为苏氨酸和第293位的甘氨酸突变为丙氨酸；
上...

【专利技术属性】
技术研发人员：董璐，陈威，赵伟，王建琴，
申请(专利权)人：中元汇吉生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：