一种靶向Mesothelin的嵌合抗原受体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种以MSLN为靶点的嵌合抗原受体、由其制备的CAR

【技术实现步骤摘要】
一种靶向Mesothelin的嵌合抗原受体及其应用

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[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种以MSLN为靶点的嵌合抗原受体、由其制备的CAR
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T细胞及其应用。

技术介绍
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[0002]CAR
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T疗法就是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，英文全称Chimeric Antigen Receptor T
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Cell Immunotherapy。这是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法。
[0003]嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)的基本结构为胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域，胞外抗原识别结构域是识别肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原的单链可变区(single
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chain variable fragment，scFv)，scFv通过铰链区、跨膜区与胞内信号转导通路相连，当T细胞识别肿瘤抗原后，scFv段与肿瘤抗原结合可直接激活并启动T细胞杀伤机制。这种CAR结构使T细胞越过主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)提呈机制直接识别肿瘤细胞，避免了由于MHC分子的限制和MHC分子表达下调引起的肿瘤免疫逃逸问题；且MHC只能提呈蛋白质片段，而CAR得益于其抗原抗体机制还可识别细胞表面的多糖以及脂类蛋白；CAR<br/>‑
T细胞回输到体内识别肿瘤并激活后可稳定增殖以形成持续杀伤力，并通过释放细胞因子等方式召集其他免疫细胞协同作战。
[0004]嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T
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cell，CAR
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T)疗法在复发难治性B淋巴细胞肿瘤领域已取得了显著疗效，越来越多的研究开始研发CAR
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T疗法在其他类型肿瘤及疾病中的应用，探究新靶点，多靶点联合的CAR在其他类型肿瘤及疾病中应用的多种可能性。理想的CAR
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T靶点应高表达于肿瘤细胞，低表达或不表达于正常组织细胞，保证CAR
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T细胞能高效识别于肿瘤细胞的前提下，将脱靶毒性降到最低。
[0005]近些年随着化疗、靶向药物和造血干细胞移植的发展，AML患者的疗效已有较大的提高，急性髓细胞性白血病(AML)儿童的存活率仍然很低，在过去的40年里治疗进展甚微。尽管进行了最大强度的治疗，依旧有大约40％的儿童会复发。近三分之一的新确诊儿童和所有复发儿童都需要造血干细胞清髓治疗。总体而言，绝大部分患者无法治愈。
[0006]在过去的几年里，多种治疗方法被批准用于成人AML。然而，发生在儿童身上的AML不同于成人AML。成人的靶向治疗不太可能转化为儿童的有效治疗，因为驱动儿童白血病发生的遗传和表观遗传事件是不同的。因此，有必要开发专门针对儿科疾病的疗法。最近针对急性淋巴细胞性白血病(ALL)儿童的免疫疗法的成功发展很有希望，但是AML的免疫治疗发展缓慢，因为缺乏有效的AML特异性靶点，而这对于成功的靶向策略至关重要。
[0007]CAR
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T设计的关键在于靶抗原的选择，研究表明，间皮素(Mesothelin，MSLN)在36％的急性髓细胞白血病(AML)患者中高表达，而在正常造血细胞中几乎不表达，这使得间皮素成为一种新的细胞表面疾病标志物和急性髓细胞白血病的潜在治疗靶点。间皮素在
AML中高表达，但在正常骨髓中基本上不表达。预计儿童AML中MSLN的免疫治疗靶向将是安全和高度有益的，因为(1)正常组织中的MSLN低表达或不表达,(2)MSLN仅在体内非肿瘤细胞的腔表面表达，这是一个与血流中抗体接触最少的空间，以及(3)MSLN不在儿童的正常骨髓组织中表达。
[0008]这些治疗策略在AML中的应用还处于起步阶段，并且受到造血细胞上许多潜在靶表面抗原的共同表达的限制。本研究将通过探索构建靶向间皮素(MSLN)的MesoCAR
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T细胞对儿童AML的靶向杀伤性，及该培养体系下的MesoCAR
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T细胞的杀瘤活性及安全性，为该治疗方法的临床转化提供研究基础。

技术实现思路
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[0009]间皮素是一种新的细胞表面疾病标志物和急性髓细胞白血病的潜在治疗靶点。在部分儿童急性髓系白血病患者的白血病细胞表面高表达的靶点，而且仅在体内非肿瘤细胞的腔表面表达，不在儿童正常骨髓细胞中表达。本申请通过构建出一种靶向间皮素(Mesothelin，MSLN)的MesoCAR
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T细胞，确定其对AML的靶向杀伤性，及该培养体系下的MesoCAR
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T细胞的杀瘤的有效性，为该治疗方法的临床转化提供研究基础。
[0010]本专利技术提供的技术方案之一，是一种靶向MSLN的嵌合抗原受体，其由N端到C端顺次包括抗MSLN的Scfv片段、CD8α的铰链区、CD8α跨膜结构域和一个共刺激信号4
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1BB+CD3ζ；
[0011]进一步地，所述靶向MSLN的嵌合抗原受体，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；
[0012]更进一步地，所述靶向MSLN的嵌合抗原受体的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0013]本专利技术提供的技术方案之二，是一种免疫细胞，在其表面表达技术方案一所述靶向MSLN的嵌合抗原受体；进一步地，所述免疫细胞为CAR
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T细胞。
[0014]本专利技术提供的技术方案之三，是技术方案一所述靶向MSLN的嵌合抗原受体或技术方案二所述免疫细胞的应用，特别是在制备治疗急性髓细胞性白血病(AML)药物或组合物中的应用。
[0015]有益效果：
[0016]本专利技术制备的分泌Mesothelin抗体的MesoCAR
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T可以显著增强T细胞的特异性杀伤能力。通过探索构建出靶向间皮素(Mesothelin，MSLN)的MesoCAR
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T细胞，验证这种新型MesoCAR
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T对AML的靶向杀伤能力的有效性，如图7、8所示，杀伤48小时，在效靶比1:1时，杀伤效率最高能达到45％，达到为该疗法临床前的研究提供实验基础的意义。
附图说明：
[0017]图1CAR结构示意图；
[0018]图2重组慢病毒双酶切验证；
[0019]图3载体质粒示意图；
[0020]图4流式检测T细胞分离纯化；
[0021]图5在培养Day1/3/5/7MesoCAR
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T的细胞生长状态图；
[0022]图6流式检测病毒侵染T细胞效率图；
[0023]图7LDH法检测MesoCAR
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T在不同时间段杀伤效率图；
[0024]与对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向MSLN的嵌合抗原受体，其特征在于，由N端到C端顺次包括抗MSLN的Scfv片段、CD8α的铰链区、CD8α跨膜结构域和一个共刺激信号4
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1BB+CD3ζ；所述靶向MSLN的嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的一种靶向MSLN的嵌合抗原受体，其特征在于，其编码基因的核苷酸序列如S...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵梦莲，马文建，周飒，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：