一种用于miRNA-222检测的碳点构建Y型DNA结构的电致化学发光生物传感器制造技术

本发明专利技术公开一种用于miRNA

【技术实现步骤摘要】
具有的高导电性、生物兼容性和比表面积大的特点，而被用来富集固载大量CDs，实现其在传感界面的有效富集，达到增强信号的目的，再结合锁核酸技术，构建“Y”型DNA结构的电致化学发光生物传感器，成功实现甲状腺乳头状癌相关基因miRNA
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222的检测。
[0008]3. 本专利技术的一种用于miRNA
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222检测的碳点构建Y型DNA结构的电致化学发光生物传感器，依序包括如下步骤：（1）碳点（CDs）的合成碳纤维作为前驱体，采用硝酸为氧化剂，利用加热回流法合成CDs。实验过程如下：首先精确称取750 mg碳纤维剪成细碎小段后，置于250 mL三颈圆底烧瓶中，于圆底烧瓶加入150 mL 7.5M的硝酸溶液，使用球形冷凝管冷凝回流，油浴锅加热至圆底烧瓶中反应溶液沸腾，以溶液沸腾开始计时，反应12个小时后，结束反应，自然冷却至室温，收集反应后的溶液。加入适量的NaOH固体，将合成的CDs溶液pH调至中性后，以8000 rpm的转速离心10 min ，以去除沉淀。然后依次用微孔滤膜过滤（0.45 μm和0.22 μm）去除杂质，将过滤溶液装入截留分子量（Molecular Weight Cut
‑
off，MWCO）为1000 Dalton的透析袋中透析48小时除去小分子盐。再将充分透析后的溶液用截留分子量为3 kD的超滤管超滤（10000 rpm，30 min），收集小于3 kD的溶液即为实验所需碳点，经旋蒸浓缩，冷冻干燥，得到一定质量CDs固体，用超纯水配制成高浓度CDs母液，置于4 ℃下保存，备用。
>[0009]（2）CDs
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PEI
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GO的合成氧化石墨烯（GO）溶液的制备：精确称取GO固体50 mg，溶于50 mL超纯水中充分震荡溶解，然后常温下超声5 h，得到分散均匀、浓度为1 mg/mL溶液。
[0010]PEI
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GO的合成：移取20 mL溶解好的GO溶液于三颈圆底烧瓶中，加入6.67 mg PEI，60 ℃ 油浴下加热，冷凝回流12 h，室温下自然冷却，获得的产物离心（12000 rpm，15 min）、洗涤，产物用超纯水重新分散，备用。
[0011]CDs
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PEI
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GO的合成：4 mL以上制得的PEI
‑
GO溶液与1 mL CDs混合搅拌混匀，80 ℃条件下加热回流3 h，所得溶液离心洗涤，重新分散在超纯水中，置于4 ℃下保存，备用。
[0012]（3）标记CDs
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PEI
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GO的辅助探针的制备将200 μL EDC和NHS（4:1）的混合溶液加入到0.5 mL CDs
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PEI
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GO溶液中，振荡反应0.5 h，然后加入 20 μL辅助探针（10 μM）于活化后的CDs
‑
PEI
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GO溶液中，室温下振荡反应2 h 。为了洗去多余的辅助探针，将混合溶液离心（15000 rpm、15min）、洗涤，得到标记CDs
‑
PEI
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GO的辅助探针，重新分散在杂交液中，4 ℃下保存，备用。
[0013]（4） 用于microRNA
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222检测的ECL生物传感器的制备GCE依次在0.3、0.05 μm 的Al2O3粉末中打磨、抛光至镜面，然后分别放入1:1 HNO3（8 M）、无水乙醇及超纯水中超声，N2吹干。（1）将GCE置于5 mL含10 mM 2
‑
氨基对苯二甲酸（ATA）的10 mM PBS溶液中，在0.2 ~ 1.2 V的电压范围内，以50 mV/s的扫描速度连续扫描4圈，使ATA氧化电聚合在GCE表面，获得 GCE/ATA电极；（2）将GCE/ATA电极置于5 mL含有100 mM K2S2O8和60 mM H2O2的0.1 M PBS溶液中，在0 ~
ꢀ‑
1.6 V 之间持续扫描4圈，得到电化学活化的电极GCE/ATA(
Ω↓
)；（3）将GCE/ATA(
Ω↓
) 放入含有2.8 mM HAuCl4的0.5 M H2SO4溶液中，在
‑
0.2 V的电压下通过计时电流法（i
‑
t 法）沉积100 s，得到金纳米粒子修饰电极GCE/ATA(
Ω↓
)/AuNPs；（4）取5 μL浓度为1 μM的双端氨基锁核酸修饰的捕获探针滴于GCE/ATA(
Ω↓
)/AuNPs电极表面，室温下反应2 h，用pH 7.40的Tris
‑
HCl缓冲液清洗后，氮气吹
干，得到GCE/ATA(
Ω↓
)/AuNPs/ssDNA电极；（5）修饰电极浸没在1 mM MCH溶液中封闭1 h，pH 7.40的Tris
‑
HCl缓冲液清洗，氮气吹干，即可得到修饰有捕获探针和巯基己醇的GCE/ATA(
Ω↓
)/AuNPs/ssDNA/MCH电极；（6）取5 μL 标记CDs
‑
PEI
‑
GO的辅助探针和目标物miRNA
‑
222的混合溶液滴于GCE/ATA(
Ω↓
)/AuNPs/ssDNA/MCH电极表面，在37 ℃下杂交50 min后，得到GCE/ATA(
Ω↓
)/AuNPs/dsDNA 修饰电极。
[0014]本专利技术优点：一种用于miRNA
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222检测的碳点构建Y型DNA结构的电致化学发光生物传感器工作原理图，采用电活化ATA膜与Au NPs构建组装基底、PEI
‑
GO富集CDs和K2S2O8‑
H2O2双共反应剂，三者协同作用下，可有效增强CDs的ECL信号，提高方法灵敏度。同时利用锁核酸技术设计探针结合“Y”型DNA结构，显著提高传感器的选择性和特异性，具有检测灵敏特异、价格低廉、简单易得的显著优势。
附图说明
[0015]图1为本专利技术一种用于miRNA
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222检测的碳点构建Y型DNA结构的电致化学发光生物传感器工作原理图。
[0016]图2为本专利技术一种用于miRNA
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222检测的碳点构建Y型DNA结构的电致化学发光生物传感器中：A为裸GCE扫描电镜表征图，B为电聚合ATA并沉积AuNPs的GCE扫描电镜表征图。
[0017]图3为本专利技术一种用于miRNA
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222检测的碳点构建Y型DNA结构的电致化学发光生物传感器中：A为CDsHRTEM图、C为GOHRTEM图、D 为CDs
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PEI
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GO的HRTEM图，B 为CDs的粒径分布图。
[0018]图4为本专利技术一种用于miRNA
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222检测的碳点构建Y型DNA结构的电致化学发光生物传本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于miRNA
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222检测的碳点构建Y型DNA结构的电致化学发光生物传感器，其特征在于，结合碳点CDs和锁核酸技术构建一种“Y”型DNA结构的电致化学发光生物传感器，用于甲状腺乳头状癌相关基因miRNA
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222的特异灵敏检测。2.根据权利要求1所述的用于miRNA
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222检测的碳点构建Y型DNA结构的电致化学发光生物传感器，其特征在于，用于检测miRNA
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222的锁核酸探针包括：（1）双氨基修饰锁核酸发卡捕获探针（CP），序列：5'
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NH2‑
C6‑
GGCTGTTTTTT GAGA(C
L
)CCACGATAGATTTTTTTCAGCC
‑
C6‑
NH2‑
3'；（2）氨基修锁核酸辅助探针（AP），序列：5'
‑
TCTATCGGTAG(C
L
)CAGAT(G
L
) TAGCT
ꢀ‑
C6‑
NH2‑
3'。3.根据权利要求1或2所述的用于miRNA
‑
222检测的碳点构建Y型DNA结构的电致化学发光生物传感器，其特征在于，碳点构建Y型DNA结构的CDs
‑
PEI
‑
GO复合物修饰锁核酸辅助探针的制备方法，包括如下步骤：取20 mL 1 mg/mL GO溶液于三颈圆底烧瓶中，加入6.67 mg PEI，60 ℃ 油浴下加热，冷凝回流12 h，室温下自然冷却，获得的PEI
‑
GO产物溶液离心、洗涤，用超纯水重新分散制得PEI
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GO溶液；然后取4 mL PEI
‑
GO溶液与1 mL CDs混合搅拌混匀，80 ℃条件下加热回流3 h，所得CDs
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PEI
‑
GO产物溶液离心、洗涤，重新分散制得CDs
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PEI
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GO溶液；取200 μL EDC和NHS的混合溶液加入到0.5 mL CDs
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PEI
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GO溶液中，振荡反应0.5 h，然后加入 20 μL 10 μM的氨基修锁核酸辅助探针（AP），室温下振荡反应2 h获得混合溶液，将混合溶液离心、洗涤，得到标记CDs
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PEI
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GO的锁核酸辅助探针，并重新分散在由10 mM Tris
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HCl缓冲液和100 mM NaCl组成的pH 7.4的杂交溶液中，4 ℃下保存，备用。4.根据权利要求1、2或3所述的用于miRNA
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222检测的碳点构建Y型DNA结构的电致化学发光生物传感器，其特征在于，碳点构建Y型DNA结构为：在电极表面采用miRNA
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222与双氨基修饰锁核酸发卡捕获探针（CP）、标记CDs
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PEI
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GO的锁核酸辅助探针杂交后，在电极表面形成Y型DNA结构。5.根据权利要求1、2、 3或4所述的用于miRNA
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222检测的碳点构建Y型DNA结构的电致化学发光生物传感器，其特征在于，电致化学发光生物传感器的制备方法，包括如下步骤：（1）玻碳电极（GCE）依次在0.3、0.05 μm 的Al2O3粉末中打磨、抛光至镜面，然后分别放入1:1 HNO3、无水乙醇及超纯水中超声，其中HNO3浓度8 M，N2吹干，备用；（2）将GCE置于5 m...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷云，刘爱林，林木土，张子阳，张宇，韩舒桦，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：