一种构建重组大肠杆菌高效合成血红素的方法技术

本发明专利技术公开了一种构建重组大肠杆菌高效合成血红素的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术通过敲除大肠杆菌C5途径的hemL基因，同时引入C4途径的5

【技术实现步骤摘要】
一种构建重组大肠杆菌高效合成血红素的方法


[0001]本专利技术涉及一种构建重组大肠杆菌高效合成血红素的方法，属于生物


技术介绍

[0002]血红素(heme)是一种含有亚铁离子的金属卟啉，是优质的铁原，可作为补铁剂用于食品加工和制造。目前化学合成和使用有机提取或酶水解生物材料制备血红素的工艺复杂、低产、耗时，且环境非友好。利用重组细菌生物合成血红素是大规模生产血红素最有前途的方法，但是目前产量低，不适合工业化生产，因此通过代谢工程改造提升重组菌的血红素合成能力非常必要。
[0003]生物体内血红素合成可分为C4和C5两条途径，其区别在于前体5
‑
氨基乙酰丙酸(5
‑
ALA)的合成。在C4途径中ALA合酶(ALAS，hemA)催化L
‑
甘氨酸(L
‑
Gly)和琥珀酰
‑
CoA缩合形成5
‑
ALA，只需一步反应；在C5途径中谷氨酸tRNA合酶(GluTS，gltX)催化L
‑
谷氨酸(Glu)形成谷氨酰
‑
tRNA，继而谷氨酰
‑
tRNA还原酶(GluTR，hemA)催化谷氨酰
‑
tRNA形成谷氨酸
‑1‑
半醛，后者经谷氨酰
‑1‑
半醛
‑
2,1
‑
变位酶(GSAM，hemL)转氨生成5
‑
ALA，需要三步酶催化反应。一般在一种生物体中仅存在C4或C5中的一种；比如大肠杆菌以C5途径合成血红素。由5
‑
ALA到血红素仍需7步反应，其中2分子的5
‑
ALA被胆色素原合酶(hemB编码)不对称缩合，产生吡咯衍生物胆色素原(Porphobilinogen，PBG)，以及亚铁螯合酶(hemH编码)将Fe
2+
插入原卟啉IX(PPIX)形成血红素为关键步骤。
[0004]目前通过代谢工程改造提升大肠杆菌的血红素合成能力，主要基于血红素的合成途径，具体包括：1)增加前体物的供给，例如GluTS的过表达，提高5
‑
ALA的水平，但GluTS受终产物血红素的反馈控制，而且单个基因的过表达会影响途径中其他基因的表达水平；2)将途径模块化，调整各模块之间的基因表达强度，涉及多基因、多载体，增加了宿主的代谢负担；3)引入C4途径，但由于C5与C4途径并存，会导致两途径相互竞争，影响终产物血红素的合成。
[0005]因此，有必要开发更多不同类型的重组大肠杆菌，进一步提高血红素的合成。

技术实现思路

[0006]为了解决上述至少一个问题，本专利技术通过阻断C5途径，引入球形红细菌的ALAS，将大肠杆菌固有的C5途径变更为C4途径，而非C4与C5共存，同时强化关键基因hemB或hemH的表达，以达到提高血红素产量的目的。本专利技术敲除了大肠杆菌C5途径的hemL基因，引入球形红细菌的ALAS基因hemA
R
，进一步结合从5
‑
ALA至血红素合成的基因hemB或hemH的过表达，构建了高效合成血红素的重组大肠杆菌。
[0007]本专利技术的第一个目的是提供高效合成血红素的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌敲除或沉默了编码谷氨酸
‑1‑
半醛
‑
2,1
‑
氨基变位酶的hemL基因，并且过表达了球形红细菌的ALAS基因hemA
R
。
[0008]在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌，还过表达了编码大肠杆菌亚铁螯合酶的
hemH基因。
[0009]在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌，还过表达了编码大肠杆菌胆色素原合酶的hemB基因。
[0010]在一种实施方式中，所述hemL基因编码的氨基酸序列是NCBI上GenBank为CAQ30669.1的序列；hemA
R
基因编码的氨基酸序列是NCBI上GenBank为AAA72325.1的序列、hemH基因编码的氨基酸序列是NCBI上GenBank为CAQ30948.1的序列，hemB基因编码的氨基酸序列是NCBI上GenBank为CAQ30840.1的序列。
[0011]在一种实施方式中，hemL基因是通过Red同源重组的方法进行敲除。
[0012]在一种实施方式中，hemA
R
基因、hemH基因或hemB基因，是通过质粒在宿主中进行表达。
[0013]在一种实施方式中，宿主是大肠杆菌BL21(DE3)。
[0014]在一种实施方式中，质粒载体是pCDFDuet1。
[0015]本专利技术的第二个目的是一种提高大肠杆菌血红素产量的方法，所述方法包括敲除或沉默编码谷氨酸
‑1‑
半醛
‑
2,1
‑
氨基变位酶的hemL基因，并且过表达球形红细菌的ALAS基因hemA
R
。
[0016]在一种实施方式中，所述方法过表达了编码亚铁螯合酶的hemH基因或编码胆色素原合酶的hemB基因。
[0017]本专利技术的第三个目的是提供一种生产血红素的方法，所述方法包括利用本专利技术的重组大肠杆菌进行发酵生产。
[0018]在一种实施方式中，所述发酵是将重组菌以1～5％的接种量接入发酵培养基中，在30～37℃条件下培养至OD600为0.6
‑
0.8，加入终浓度0.1～0.5mmol
·
L
‑1的IPTG，诱导培养8～16h。
[0019]本专利技术的第四个目的是提供所述重组大肠杆菌或上述提高大肠杆菌血红素产量的方法在合成血红素中的应用。
[0020]有益效果：
[0021]本专利技术通过敲除大肠杆菌C5途径的hemL基因，同时引入球形红细菌的5
‑
氨基乙酰丙酸(5
‑
aminolevulinicacid，5
‑
ALA)合酶，构建C4途径，并强化大肠杆菌hemB或hemH的表达，以达到提高血红素产量的目的。本专利技术构建的基因工程菌与出发菌株相比，血红素含量大幅提升，最佳者血红素浓度达到59.46μmol
·
L
‑1。
附图说明
[0022]图1为血红素代谢改造示意图。
具体实施方式
[0023]1、LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10，pH7.0。
[0024]2、血红素浓度测定：
[0025]采用荧光法检测血红素浓度，具体为：取培养后的适量菌体，使得OD
600
×
菌液体积(mL)＝8(例如：若菌体的OD
600
值为0.4，则取20mL菌液)，于4℃，12000r/min离心5min后得到菌体沉淀，水洗后加入1.5mL琥珀色离心管；向1.5mL离心管加入5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种合成血红素的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌敲除或沉默了编码谷氨酸
‑1‑
半醛
‑
2,1
‑
氨基变位酶的hemL基因，并且过表达了球形红细菌的ALAS基因hemA
R
。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌还过表达了编码大肠杆菌亚铁螯合酶的hemH基因，或编码大肠杆菌胆色素原合酶的hemB基因。3.根据权利要求1
‑
2任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述hemL基因编码的氨基酸序列是NCBI上GenBank为CAQ30669.1的序列；hemA
R
基因编码的氨基酸序列是NCBI上GenBank为AAA72325.1的序列；hemH基因编码的氨基酸序列是NCBI上GenBank为CAQ30948.1的序列；hemB基因编码的氨基酸序列是NCBI上GenBank为CAQ30840.1的序列。4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述hemL基因是通过Red同源重组的方法进行敲除。5.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐蕾，张鑫，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：