用于纯化间-Α抑制剂蛋白的方法技术

本文描述了使用内毒素结合剂从生物材料中纯化IαIp的方法。所述方法涉及将包含所述IαIp的所述生物材料施加至内毒素结合剂、弃去流穿液、施加一种或多种洗涤缓冲液以及从所述内毒素结合剂中洗脱所述IαIp。内毒素结合剂中洗脱所述IαIp。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于纯化间
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Α
抑制剂蛋白的方法

技术介绍

[0001]间
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α抑制剂蛋白(IαIp)是天然存在的免疫调节血浆蛋白家族，其在所有哺乳动物的血液中以高浓度循环。IαIp促进对感染、创伤和损伤引起的炎症的保护作用。IαIp的保护作用独立于致病微生物剂或触发物。
[0002]此家族的成员由通过糖胺聚糖共价连接的重链和轻链多肽亚基构成。IαIp在体内可作为间
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α抑制剂(IαI)(一种由两条重链(H1和H2)和一条轻链(L)构成的250kDa分子，称为双库尼茨抑制剂)和前
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α抑制剂(PαI)(一种由一条重链(H3)和一条轻链(L)构成的125kDa分子)存在。
[0003]当身体产生炎性信号诸如在受伤或感染期间引起的信号时，IαIp进入组织并且直接到达炎症部位。IαIp的重链通过与作为炎性级联反应的一部分的蛋白质诸如补体和细胞外组蛋白(损伤信号)结合从而减弱炎性过程来增强抗炎性反应，而轻链双库尼茨抑制剂抑制丝氨酸蛋白酶诸如胰蛋白酶、弹性蛋白酶、纤溶酶、组织蛋白酶G和弗林蛋白酶的活性。
[0004]IαIp已在体外和体内模型中被证明促进损伤后的肺上皮修复，并且IαIp也已在多个体内模型中被证明下调炎性细胞因子诸如TNF
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α和IL
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6。
[0005]在健康个体中，血液中循环IαIp的量相对较高(在400mg/L至800mg/L之间)。在新生儿和成人患者的全身炎症/脓毒症期间，IαIp水平迅速下降(Baek YW等人J Pediatr.2003；143:11
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15；Lim YP等人J Infect Dis.2003；188:919
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926；以及Opal SM等人Crit Care Med.2007；35:387
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392)，并且降低的IαIp水平已被证明与疾病进展密切相关。IαIp疗法已被描述用于治疗脓毒症和相关联的器官损伤、肺炎、急性呼吸道疾病、坏死性小肠结肠炎(NEC)、伤口、烧伤、癌症、卒中和阿尔茨海默病。
[0006]先前，IαIp使用分步提取，然后层析分离来制备。虽然这些方法可实现高纯度(例如，纯度>90％)，但这些方法存在IαIp产率低的缺点(例如，20％至30％(w/w))。因此，需要以高产率和纯度纯化或制备IαIp的方法以用于在例如治疗组合物的制备中使用。

技术实现思路

[0007]本公开的特征在于纯化IαIp(例如，IαI、PαI和双库尼茨抑制剂中的一种或多种)的方法。该方法涉及将含有IαIp的生物材料(例如，血液或乳)诸如获自受试者(例如，人)的生物材料施加至内毒素结合剂(例如，固体支持物，诸如层析柱，其含有内毒素结合剂)，作为纯化工艺中的一个步骤。
[0008]本公开的第一方面的特征在于一种通过以下步骤从生物材料中纯化间
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α抑制剂蛋白(IαIp)的方法：(a)将包含IαIp的生物材料施加至内毒素结合剂，并且分离包含不与内毒素结合剂结合的生物材料的流穿液；以及(b)将包含盐的洗脱缓冲液施加至内毒素结合剂，并且收集包含IαIp的洗脱物。
[0009]在若干实施例中，将内毒素结合剂固定在支持物(例如，整体支持物或基于颗粒的支持物)上。在若干实施例中，整体支持物或基于颗粒的支持物为树脂或包含树脂。支持物可以为例如柱、膜、圆盘或芯片。
Tris
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HCl(例如，约20mM Tris
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HCl)。在一些实施例中，洗脱缓冲液包含约1,000mM NaCl或更少(例如，约500mM至约1,000mM NaCl(例如，约500mM NaCl或约1,000mM NaCl))。在一些实施例中，洗脱缓冲液包含约20mM Tris和约500mM NaCl。
[0016]在一些实施例中，方法进一步包括在施加洗脱缓冲液之后将第二洗脱缓冲液施加至内毒素结合剂，该第二洗脱缓冲液具有约4.5至约8.5的pH(例如，约pH 7.2)。在一些实施例中，第二洗脱缓冲液包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris
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HCl中的一种或多种。在一些实施例中，第二洗脱缓冲液包含约5mM至约100mM Tris
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HCl(例如，约20mM Tris
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HCl)。在一些实施例中，第二洗脱缓冲液包含约1,000mM NaCl或更少(例如，约500mM至约1,000mM NaCl(例如，约500mM NaCl或约1,000mM NaCl))。在一些实施例中，第二洗脱缓冲液包含约20mM Tris和约1,000mM NaCl。
[0017]在一些实施例中，方法进一步包括在步骤(a)之前将稀释缓冲液施加至生物材料。在一些实施例中，稀释缓冲液包含去离子水。在一些实施例中，稀释缓冲液包含纯化水。在一些实施例中，稀释缓冲液具有约4.5至约8.5的pH(例如，约pH 5.5、约pH 7.2或约pH 7.3)。在一些实施例中，将生物材料用稀释缓冲液按1:1至1:10(v/v)稀释。在一些实施例中，稀释缓冲液包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris
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HCl中的一种或多种。在一些实施例中，稀释缓冲液包含约5mM至约100mM Tris
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HCl(例如，约20mM Tris
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HCl)。在一些实施例中，稀释缓冲液包含约50mM NaCl或更少(例如，无盐、无NaCl或约50mM NaCl)。在一些实施例中，稀释缓冲液包含约5mM至约100mM磷酸盐(例如，15mM磷酸盐)。
[0018]在一些实施例中，方法进一步包括在步骤(a)之前调节生物材料的pH。在一些实施例中，方法包括在步骤(a)之前通过添加乙酸将生物材料的pH调节至约4.5至约8.5(例如约pH 5.5、约pH 7.2或约pH 7.3)。在一些实施例中，方法进一步包括在步骤(a)之前调节生物材料的电导率。在一些实施例中，方法包括在步骤(a)之前将生物材料的电导率调节至约10mS/cm至约30mS/cm、约15mS/cm至约25mS/cm(例如约20mS/cm)。
[0019]在一些实施例中，方法进一步包括检测流穿液中的IαIp的量。在一些实施例中，方法包括弃去流穿液。
[0020]在一些实施例中，方法进一步包括检测洗脱物中的IαIp的量。
[0021]在一些实施例中，方法包括约1mL/min至10mL/min的流速。
[0022]在一些实施例中，方法进一步包括将生物材料施加至层析支持物(例如，阴离子交换层析支持物、尺寸排阻层析支持物、离子交换层析支持物、亲和层析支持物或其组合)。在一些实施例中，层析支持物为所述阴离子交换层析支持物。
[0023]在一些实施例中，该方法进一步包括：(i)将生物材料施加至层析支持物，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种从生物材料中纯化间
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α抑制剂蛋白(IαIp)的方法，所述方法包括：(a)将包含所述IαIp的所述生物材料施加至内毒素结合剂，并且分离包含不与所述内毒素结合剂结合的所述生物材料的流穿液；以及(b)将包含盐的洗脱缓冲液施加至所述内毒素结合剂，并且收集包含所述IαIp的洗脱物。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述内毒素结合剂固定在支持物上。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述支持物为整体支持物或基于颗粒的支持物。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述整体支持物或基于颗粒的支持物为树脂或包含树脂。5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述支持物包括柱、膜、圆盘或芯片。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述内毒素结合剂选自由以下各项组成的组：ETOXICLEAR
TM
、PIERCE
TM
高容量内毒素去除树脂、TOXINERASER
TM
内毒素去除树脂、PURKINE
TM
内毒素去除树脂、DETOXI
‑
GEL
TM
内毒素去除凝胶和PROMEGA
TM
内毒素去除树脂。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述内毒素结合剂为DETOXI
‑
GEL
TM
或ETOXICLEAR
TM
。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述生物材料进一步包含三种或更多种选自由以下各项组成的组的蛋白质：α
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1抗胰蛋白酶、C1
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抑制剂、白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原(因子I)、凝血酶原(因子II)、凝血酶、抗凝血酶III、因子III、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、纤连蛋白、α
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2纤溶酶抑制剂、尿激酶、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相关蛋白酶抑制剂、纤溶酶原、组织纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制剂
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1、纤溶酶原激活物抑制剂
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2、血管性血友病因子、因子H、前激肽释放酶、高分子量激肽原和肝素辅因子II。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述球蛋白为免疫球蛋白(Ig)。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述免疫球蛋白选自由以下各项组成的组：IgA、IgE、IgM、IgD和IgG。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述IgG选自由以下各项组成的组：静脉内Ig(IVIg)、抗
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D IgG、乙型肝炎IgG、麻疹IgG、狂犬病IgG、破伤风IgG和水痘带状疱疹IgG。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述生物材料包含三至十种、三至十五种、三至二十种、三至二十五种、三至三十种、十至二十种、十至二十五种、十至三十种、十五至二十五种、十五至三十种、二十至三十种、或三十或更多种不同的蛋白质。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述生物材料包含约40％至约65％白蛋白(w/w)。14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述生物材料包含约25％至约45％球蛋白(w/w)。15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述生物材料包含约2％至约12％纤维蛋白原(w/w)。16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在步骤(a)之后并且在步骤(b)之前将第一洗涤缓冲液施加至所述内毒素结合剂。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述方法进一步包括分离包含所述第一洗涤缓冲液的流穿液。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述第一洗涤缓冲液具有约4.5至8.5的pH。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述第一洗涤缓冲液具有约5.2的pH。20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中所述第一洗涤缓冲液包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris
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HCl中的一种或多种。21.根据权利要求16至20中任一项所述的方法，其中所述第一洗涤缓冲液包含约10mM至约200mM甘氨酸和/或约20mM至300mM乙酸。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一洗涤缓冲液包含约75mM甘氨酸和约100mM乙酸。23.根据权利要求16至22中任一项所述的方法，其中所述第一洗涤缓冲液包含约200mM或更少的NaCl。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一洗涤缓冲液包含约50mM至约150mM NaCl。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述第一洗涤缓冲液包含约50mM NaCl或约100mM NaCl。26.根据权利要求16至25中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在施加所述第一洗涤缓冲液之后将第二洗涤缓冲液施加至所述内毒素结合剂。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述方法进一步包括分离包含所述第二洗涤缓冲液的流穿液。28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述第二洗涤缓冲液具有约4.5至约8.5的pH。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述第二洗涤缓冲液具有约7.2的pH。30.根据权利要求26至29中任一项所述的方法，其中所述第二洗涤缓冲液包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris
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HCl中的一种或多种。31.根据权利要求26至30中任一项所述的方法，其中所述第二洗涤缓冲液包含约5mM至约100mM Tris
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HCl。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述第二洗涤缓冲液包含约20mM Tris
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HCl。33.根据权利要求26至32中任一项所述的方法，其中所述第二洗涤缓冲液包含约500mM或更少的NaCl。34.根据权利要求33所述的方法，其中所述第二洗涤缓冲液包含约100mM至约500mM NaCl。35.根据权利要求34所述的方法，其中所述第二洗涤缓冲液包含约300mM NaCl。36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液具有约4.5至约8.5的pH。37.根据权利要求36所述的方法，其中所述洗脱缓冲液具有约7.2的pH。38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris
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HCl中的一种或多种。39.根据权利要求1至38中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包含约5mM至约100mM Tris
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HCl。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包含约20mM Tris
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HCl。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包含约1,000mM或更少的NaCl。42.根据权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包含约500mM至约1,000mM NaCl。43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包含约500mM NaCl或约1,000mM NaCl。44.根据权利要求1至43中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在步骤(a)之前将稀释缓冲液施加至所述生物材料。45.根据权利要求44所述的方法，其中所述稀释缓冲液包含去离子水。46.根据权利要求44或45所述的方法，其中所述稀释缓冲液具有约4.5至约8.5的pH。47.根据权利要求46所述的方法，其中所述稀释缓冲液具有约5.5、约7.2或约7.3的pH。48.根据权利要求44至47中任一项所述的方法，其中将所述生物材料用所述稀释缓冲液按1:1至1:10(v/v)稀释。49.根据权利要求44至48中任一项所述的方法，其中所述稀释缓冲液包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris
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HCl中的一种或多种。50.根据权利要求44至49中任一项所述的方法，其中所述稀释缓冲液包含约5mM至约100mM Tris
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HCl。51.根据权利要求50所述的方法，其中所述稀释缓冲液包含约20mM Tris
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HCl。52.根据权利要求44至51中任一项所述的方法，其中所述稀释缓冲液包含约50mM或更少的NaCl。53.根据权利要求52所述的方法，其中所述稀释缓冲液不包含盐或包含约50mM NaCl。54.根据权利要求44至53中任一项所述的方法，其中所述稀释缓冲液包含约5mM至约100mM磷酸盐。55.根据权利要求54所述的方法，其中所述稀释缓冲液包含约15mM磷酸盐。56.根据权利要求1至55中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括检测所述流穿液中的所述IαIp的量。57.根据权利要求56所述的方法，其中所述方法包括弃去所述流穿液。58.根据权利要求1至57中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括检测所述洗脱物中的IαIp的量。59.根据权利要求1至58中任一项所述的方法，所述方法包括约1mL/min至10mL/min的流速。60.根据权利要求1至58中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前，所述方法包括将所述生物材料施加至层析支持物。61.根据权利要求60所述的方法，其中所述层析支持物包括阴离子交换层析支持物、尺寸排阻层析支持物、离子交换层析支持物、亲和层析支持物或其组合。62.根据权利要求61所述的方法，其中所述层析支持物为所述阴离子交换层析支持物。63.根据权利要求60至62中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括：(i)将所述生物材料施加至所述层析支持物，并且分离步骤(i)的包含不与所述层析支持物结合的所述生物材料的流穿液；以及
(ii)将包含盐的洗脱缓冲液施加至所述层析支持物，并且收集包含所述IαIp的第一洗脱物。64.根据权利要求63所述的方法，其中所述层析支持物为整体支持物或基于颗粒的支持物。65.根据权利要求64所述的方法，其中所述整体支持物或基于颗粒的支持物包含固定化阴离子交换树脂。66.根据权利要求65所述的方法，其中所述固定化阴离子交换树脂为二乙基氨基乙烷(DEAE)树脂或季胺(Q)树脂。67.根据权利要求60至66中任一项所述的方法，其中所述层析支持物为柱、膜、圆盘或芯片。68.根据权利要求60至67中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在步骤(i)之后并且在步骤(ii)之前将第一洗涤缓冲液施加至所述层析支持物。69.根据权利要求68所述的方法，其中在步骤(ii)之前，所述方法进一步包括分离包含所述第一洗涤缓冲液的流穿液。70.根据权利要求68或69所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第一洗涤缓冲液具有约4.5至约8.5的pH。71.根据权利要求70所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第一洗涤缓冲液具有约7.2的pH。72.根据权利要求68至71中任一项所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第一洗涤缓冲液包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris
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HCl中的一种或多种。73.根据权利要求68至72中任一项所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第一洗涤缓冲液包含约5mM至约100mM Tris
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HCl。74.根据权利要求73所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第一洗涤缓冲液包含约20mM Tris
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HCl。75.根据权利要求68至74中任一项所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第一洗涤缓冲液包含约400mM或更少的NaCl。76.根据权利要求75所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第一洗涤缓冲液包含约50mM至约250mM NaCl。77.根据权利要求76所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第一洗涤缓冲液包含约250mM NaCl。78.根据权利要求68至77中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在施加所述第一洗涤缓冲液之后将第二洗涤缓冲液施加至所述层析支持物。79.根据权利要求78所述的方法，其中所述方法进一步包括分离包含所述第二洗涤缓冲液的流穿液。80.根据权利要求78或79所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第二洗涤缓冲液具有约4.5至约8.5的pH。81.根据权利要求80所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第二洗涤缓冲液具有约5.2的pH。
8...

【专利技术属性】
技术研发人员：林姚边，约瑟夫，
申请(专利权)人：普罗瑟拉生物公司，
类型：发明
国别省市：