一种细胞穿梭肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种细胞穿梭肽及其应用。所述细胞穿梭肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术还公开了一种融合多肽，由所述的细胞穿梭肽与促凋亡多肽KLA偶联。本发明专利技术涉及的RKPSSSWFWKPRYK来源于人源GSDMD蛋白质氨基酸序列，因此具有低免疫原性的特点，并且本身具有低毒性，并能将抗癌多肽KLA高效的运送到肿瘤细胞中从而起到抗肿瘤的效果。还可以利用所述细胞穿梭肽将蛋白质、药物、核酸、siRNAs、纳米粒子等运送至肿瘤细胞中从而增强抗肿瘤效果，也可以与抗肿瘤药物偶联，起到降低抗肿瘤药物的使用剂量和毒性，或发挥逆转肿瘤耐药的作用。作用。作用。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞穿梭肽及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种细胞穿梭肽及其应用。

技术介绍

[0002]肿瘤是危害人类健康的严重疾病之一，目前恶性肿瘤的治疗效果仍不理想，尤其多数恶性肿瘤晚期往往已经失去了手术治疗的时机，只能通过放疗及化疗进行保守治疗，但放疗及化疗副作用大，例如化疗中抗肿瘤化学药物治疗所需的用药剂量较大，毒副作用也大，严重影响了肿瘤患者的化疗效果。肿瘤治疗从基础研究到药物开发的一个难以克服的障碍来源于细胞膜通透性低。因此，改善化疗药物跨膜转位能力将能明显降低抗肿瘤药物的有效剂量，从而减少不良反应。
[0003]目前，治疗药物分子的传递不良和生物利用度低是抗肿瘤药物开发过程中的两大主要障碍，尽管电穿孔、显微注射、脂质体转染和病毒载体等传递系统已被广泛应用，但它们仍然存在效率低、细胞毒性大、生物利用度低及不能用于体内研究等缺点。细胞穿梭肽(Cell penetrating peptides，CPPs)能够以无毒的方式将治疗和诊断分子送入细胞内，作为一种有前景的非病毒药物和诊断剂递送工具，受到了相当大的关注。在大多数情况下，CPPs是一类长度为5～30个氨基酸残基组成的小肽，可通过内吞和/或巨噬细胞吞噬作用进行膜转运，而不会对膜造成明显的损伤。CPPs的这种独特能力可以用来改善细胞对各种生物活性分子的吸收，它已成功地应用于体外和体内治疗分子(如多肽、蛋白质、药物、核酸、siRNAs、纳米粒子)的输送。由于CPPs在药物输送方面的巨大应用，鉴定新型高效的CPPs已成为当前研究的热点。虽然以CPPs为基础的药物传递为最安全和最有用的治疗应用提供了巨大的机会，但每个CPP
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缀合物的细胞毒性和转运效率取决于多种因素，如CPP氨基酸序列、CPP浓度、孵育时间、温度、细胞类型和药物类型等。
[0004]但是目前发现的CPPs由于其细胞毒性大、转运效率低和免疫原性强，其应用仍然局限于狭窄的临床应用。因此，还需进一步寻找低免疫原性、低毒性高转运效率的CPPs，以提高药物如抗肿瘤药物的向细胞内输送的能力。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的缺陷，本专利技术提出了一种细胞穿梭肽及其应用。本专利技术涉及的细胞穿梭肽CPPs(多肽序列是RKPSSSWFWKPRYK，简称RYK)，是来源于人源GSDMD蛋白质氨基酸序列中的高效低毒的新型CPPs。将RYK融合凋亡诱导肽KLA(具有破坏线粒体膜、诱导癌细胞凋亡的能力，但其穿透真核细胞的能力较差)，发现新型RYK能够向肿瘤细胞内输送KLA及提高其融合多肽KLA的抗肿瘤活性。
[0006]本专利技术提供一种细胞穿梭肽，所述细胞穿梭肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1(RKPSSSWFWKPRYK)所示。
[0007]本专利技术还提供一种融合多肽，由所述的细胞穿梭肽与促凋亡多肽KLA偶联，所述融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2(RKPSSSWFWKPRYKGGKLAKLAKKLAKLAK)所示。两条多肽
合成时中间用GG连接，GG是把两条多肽连接在一起的连接臂。
[0008]本专利技术还提供一种多肽融合药物，由所述的细胞穿梭肽与抗肿瘤药物偶联。
[0009]本专利技术还提供一种多肽融合蛋白质，由所述的细胞穿梭肽与蛋白质偶联。
[0010]本专利技术还提供一种多肽融合核酸，由所述的细胞穿梭肽与核酸偶联。
[0011]本专利技术还提供一种多肽融合siRNA，由所述的细胞穿梭肽与siRNAs偶联。
[0012]本专利技术还提供一种多肽融合纳米颗粒，由所述的细胞穿梭肽与纳米颗粒偶联。
[0013]本专利技术还提供所述的细胞穿梭肽或所述的融合多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0014]本专利技术还提供所述的多肽融合药物或所述的多肽融合蛋白质或所述的多肽融合核酸或所述的多肽融合siRNA或所述的多肽融合纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0015]综上，与现有技术相比，本专利技术达到了以下技术效果：
[0016](1)来源于人源GSDMD蛋白质氨基酸序列，具有高效低毒性和低免疫原性。
[0017](2)利用生物信息学方法预测人源GSDMD蛋白质氨基酸序列中可能存在的CPPs及其特征。
[0018](3)通过流式细胞仪分析不同细胞的摄取能力、荧光显微镜和共聚焦显微镜确认RKPSSSWFWKPRYK具有能进入肿瘤细胞的潜能，而且还能进入肿瘤细胞的细胞核，并且穿梭进入细胞的能力强于公认的阳性对照R8。
[0019](4)结果表明RYK本身对肿瘤细胞是低毒性的，通过将RKPSSSWFWKPRYK与促凋亡多肽KLA偶联，一系列实验结果表明RKPSSSWFWKPRYK具有携带大分子物质KLA进入细胞的能力，且能够引起凋亡相关蛋白的增多从而引起肿瘤细胞的凋亡具有抗肿瘤的作用。说明RKPSSSWFWKPRYK可以将KLA携带进入肿瘤细胞，并不改变KLA的促凋亡作用。
[0020](5)RKPSSSWFWKPRYK融合促凋亡肽KLA后能高效的将KLA运送到肿瘤细胞中并具有明显的抗肿瘤作用。可以将RKPSSSWFWKPRYK
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KLA融合肽开发成新的抗癌多肽。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0022]图1为本专利技术的技术流程示意图。
[0023]图2为本专利技术实施例1中CellPPD(http://crdd.osdd.net/raghava/cellppd/submission.php)网站预测细胞穿梭肽。
[0024]图3为本专利技术实施例1中根据SVM score对预测到的细胞穿梭肽的序列进行排序，得分越高，是细胞穿梭肽的可能性越大。
[0025]图4为本专利技术实施例2中不同多肽细胞摄取能力的对比。
[0026]图5为本专利技术实施例3中荧光显微镜检测多肽RYK在A549和HpeG2两种细胞系中的定位。
[0027]图6为本专利技术实施例4中共聚焦显微镜检测多肽RYK在A549和HpeG2两种细胞系中的定位。
[0028]图7为本专利技术实施例5中荧光显微镜显示多肽RYK可以将KLA带入A549和HpeG2两种
细胞。
[0029]图8为本专利技术实施例5中流式细胞仪分析FITC
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KLA
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RYK的细胞摄取能力。
[0030]图9为本专利技术实施例5中CCK8法检测多肽对肿瘤细胞的细胞毒性。
[0031]图10为本专利技术实施例5中光学显微镜观察RYK
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KLA引起细胞凋亡。
[0032]图11为本专利技术实施例5中流式细胞术仪检测RYK
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KLA引起细胞凋亡，具有浓度依赖性。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞穿梭肽，其特征在于，所述细胞穿梭肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种融合多肽，其特征在于，由权利要求1所述的细胞穿梭肽与促凋亡多肽KLA偶联，所述融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种多肽融合药物，其特征在于，由权利要求1所述的细胞穿梭肽与抗肿瘤药物偶联。4.一种多肽融合蛋白质，其特征在于，由权利要求1所述的细胞穿梭肽与蛋白质偶联。5.一种多肽融合核酸，其特征在于，由权利要求1所述的细胞穿梭肽与核酸偶联。...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔霞，何志巍，曾颖，刘钰珂，吴隆吉，
申请(专利权)人：广东医科大学，
类型：发明
国别省市：