一种α-肌球蛋白突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种α

【技术实现步骤摘要】
一种
α
‑
肌球蛋白突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种α
‑
肌球蛋白突变体及其应用。

技术介绍

[0002]心肌细胞是一种高度分化的终末细胞，其收缩蛋白以α
‑
肌球蛋白(α
‑
MHC)为主，主管收缩功能。收缩蛋白包括肌球蛋白，肌动蛋白、向肌球蛋白及向宁蛋白。其中肌球蛋白包括2个重链(MHC)、2个轻链(MLC)，其中重链(MHC)由α
‑
肌球蛋白重链(α
‑
MHC)和β
‑
肌球蛋白重链(β
‑
MHC)两个基因编码，其编码的蛋白形成三个异构体，即V1(α、α同源物)、V2(α、β异同源物)和V3(β、β同源物)。不同的异构体具有不同的ATP酶活性和收缩活性，肌球蛋白的ATP酶活性主要取决于肌细胞中V1或V3的数量。α
‑
MHC比β
‑
MHC具有更高的ATP酶活性，表达α
‑
MHC蛋白的心脏比表达β
‑
MHC蛋白的心脏产生更多的能量使α
‑
MHC成为主要的收缩功能蛋白，因此α
‑
MHC主要负责心肌细胞的收缩。α
‑
MHC和β
‑
MHC均在人和小鼠心肌细胞中表达。一般来说，β
‑
MHC在人类中占优势，而α
‑
MHC在小鼠中占优势。然而，在某些生理和病理条件下，MHC类型可以发生转化，这种变化伴随着肌球蛋白ATP酶活性和心脏收缩率的变化。因此，MHC类型之间的转换是心肌细胞的适应性变化，是心脏调节自身负荷和能量供应的结果。α
‑
MHC在物种间相对保守，它也调节心脏生长和基因表达对应激和激素信号的反应。因此，尽管β
‑
MHC是正常成人心脏的主要亚型，α
‑
MHC的微小变化也会导致心肌细胞的显著改变。

技术实现思路

[0003]本专利技术目的在于提供一种α
‑
肌球蛋白突变体及其应用。
[0004]为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为：
[0005]一种α
‑
肌球蛋白突变体，其特征在于：于野生型α
‑
MHC蛋白位于1897位的赖氨酸(K)突变为精氨酸(R)。
[0006]所述野生型α
‑
MHC蛋白对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.1中碱基所示。
[0007]一种所述的α
‑
肌球蛋白突变体的应用，α
‑
肌球蛋白突变体在作为Ang II诱导的心衰病变模型中的应用。
[0008]一种检测α
‑
肌球蛋白突变体的引物，检测引物为
[0009]前引物:
‘5‑
TGTGCAGAAAACCCCCAAGTCTG
‑3’
；
[0010]后引物:
‘5‑
GAGGAACTCACCTTGGCACC
‑3’
。
[0011]一种检测α
‑
肌球蛋白突变体的试剂盒，含所述的引物。
[0012]具体为：
[0013]锁定带点突变和pGK
‑
Neomycin
‑
polyA盒的38号与39号外显子为突变区域并针对α
‑
MHC基因设计c.5690A>G(K1897R)突变载体。将靶向载体电穿孔到C57BL/6J胚胎干细胞(ES)中，按照常规方案筛选G418抗性菌落。同源重组胚胎干细胞克隆经PCR和Southern blot鉴定。使用α
‑
MHC
‑
(K1897R)小鼠突变区的特异引物组对尾部DNA进行基因分型。将高嵌合小鼠与Flp小鼠杂交得到F1代小鼠，通过PCR和引物对测序鉴定其基因型从而证实突变成
功。
[0014]本专利技术所具有的优点：
[0015]本专利技术通过CRISPR/Cas9系统的基因编辑方法获得α
‑
肌球蛋白突变体，证实α
‑
肌球蛋白中1897位点参与并调控α
‑
MHC与Titin之间相互作用程度，进而体现心衰程度，通过获得的α
‑
肌球蛋白突变体作为导致心力衰竭病变模型，其可为器质性心衰尤其是肌丝结构异常性心力衰竭的研究奠定基础。
附图说明
[0016]图1为本专利技术实施例提供的α
‑
MHC
‑
K1897R转基因小鼠的构建模式图；其中，aα
‑
MHC
‑
K1897R转基因小鼠的构建模式图；bα
‑
MHC
‑
WT突变相关区域测序结果展示；cα
‑
MHC
‑
K1897R突变相关区域测序结果展示。
[0017]图2为本专利技术实施例提供的α
‑
MHC K1897R突变减少了与Titin的结合图，其中，a小鼠心脏Titin的示意图；b Titin结构示意图；c对293T外源转染后，使用Myc抗体进行IP实验；d示意图显示α
‑
MHC
‑
K1897位点突变导致与Titin结合减少；(e
‑
h)用表达Myc
‑
α
‑
MHC
‑
WT、Myc
‑
α
‑
MHC
‑
K1249R、Myc
‑
α
‑
MHC
‑
K1533R、Myc
‑
α
‑
MHC
‑
K1897R的质粒转染HEK293T细胞，用表达Titin的Fn3片段His
‑
I106
‑
108(e)、His
‑
A77
‑
78(f)、His
‑
A80
‑
82(g)、His
‑
A84
‑
86(h)的质粒转染HEK293T细胞；(i
‑
l)用表达Myc
‑
α
‑
MHC
‑
WT、Myc
‑
α
‑
MHC
‑
K1249R、Myc
‑
α
‑
MHC
‑
K1533R、Myc
‑
α
‑
MHC
‑
K1897R的质粒转染HEK293T细胞，用表达Titin的Fn3片段His
‑
I106
‑
108(i)、His
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种α
‑
肌球蛋白突变体，其特征在于：于野生型α
‑
MHC蛋白位于1897位的赖氨酸(K)突变为精氨酸(R)。2.按权利要求1所述的α
‑
肌球蛋白突变体，其特征在于：所述野生型α
‑
MHC蛋白对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.1中碱基所示。3.一种权利要求1所述的α
‑
肌球蛋白突变体的应用，其特征在于：α
‑
肌球蛋白突变体在...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙英贤，张乃今，张莹，
申请(专利权)人：中国医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：