PAI-1基因启动子4G/5G多态性检测试剂盒、组合物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了PAI

【技术实现步骤摘要】
PAI
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1基因启动子4G/5G多态性检测试剂盒、组合物及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及PAI
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1基因启动子4G/5G多态性检测试剂盒、组合物及其应用。

技术介绍

[0002]纤溶酶原激活物抑制剂(Plasminogen activator inhibitor，PAI)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)家族，具有抑制纤维蛋白降解、促进纤维蛋白沉积于血管壁和刺激平滑肌细胞增生等作用，在维持血浆凝血
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纤溶系统的动态平衡中起到关键作用。PAI至少可以分为三类：内皮细胞型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI
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1)、胎盘型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI
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2)和蛋白酶Nexin I，其中PAI
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1的活性最强。PAI
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1的作用原理是通过组织型纤溶酶原激活剂(tPA)或尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)结合形成稳定的复合物，从而抑制纤溶酶原激活，抑制纤维蛋白溶解。生理情况下，PAI
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1密切调节凝血和纤溶系统的平衡。纤溶系统是机体抑制血栓形成的重要保护机制，PAI
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1是重要的纤溶调节剂。
[0003]PAI
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1基因位于7号染色体(q21.2
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q22)，约含12200个碱基对，包括9个外显子和8个内含子。PAI
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1启动子存在一个P53的特异位点，P53通过启动子激活，诱导PAI
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1表达，从而调控细胞纤维蛋白溶解活动。研究发现血浆PAI
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1浓度与基因表达水平明显相关。基因多态性能够影响基因表达水平，其中PAI
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1基因4G/5G多态性(rs1799762)是一种单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms，SNP)，是PAI
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1基因启动子区
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675bp处有一个单核苷酸G(鸟嘌呤，Guanine)插入，可形成4个或5个鸟嘌呤碱基序列，因此出现三种多态性，分别为4G/4G、4G/5G以及5G/5G，影响基因表达，研究证明转录起始因子位点4G、5G等位基因均存在于不同人群中，5G等位基因与抑制蛋白结合后，覆盖了阻遏蛋白与其相结合的位点，空间结构改变后干扰了PAI
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1转录水平，而4G等位基因没有转录抑制位点，导致4G等位基因转录水平是5G等位基因的6倍，进而导致PAI
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1活性水平也明显升高。PAI
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1水平升高可引起血小板聚集趋势增加，增加形成静脉血栓的风险。有文献表明4G/4G基因型者发生静脉血栓的风险是5G/5G型(正常纤溶型)的6.35倍，4G/5G基因型者发生静脉血栓的风险是5G/5G型的4.85倍。大量研究表明PAI
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1基因5G等位基因能够通过下调PAI
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1基因表达从而引起血浆PAI
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1浓度降低，对纤溶系统活性抑制作用减弱，表现为出血倾向。更有研究发现，临床上肥胖、高脂血症、糖尿病、心绞痛、动脉粥样硬化等患者血浆PAI
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1水平明显升高，而尿激酶、低分子肝素等增加纤溶活性的细胞因子水平上升时，PAI
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1水平往往呈下降状态。PAI
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1活性不仅反映了纤溶系统的状态，也反映了血管内皮细胞功能及机体清除血栓的水平，4G/5G多态性(rs1799762)对于血栓预防诊断具有重要意义。研究表明，4G/5G多态性与脑血管病具有相关性，4G纯合子个体具有较高的脑梗死发病倾向(张晨，李江，李玲，等.PAI
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1启动子区插入/缺失(5G/4G)多态性与脑血管病的相关性研究[J].中华医学遗传学杂志，2001，18(5)：383
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387.)。PAI
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1基因多态性还与与妊娠相关疾病(如：复发性自然流产(Recurrent spontaneous abortion，RSA)、妊娠期高血压疾病(Hypertensive disorders of pregnancy，HDP)、妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellims，GDM))等的发生、发展具
有一定相关性。刘美玉等人报道了4G/4G基因型和4G等位基因患不明原因复发性流产(Unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)的相对风险增加(刘玉美，胡春青，唐晓勇，等.不明原因复发性流产患者血浆中PAI
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1水平表达及其基因启动区4G/5G位点多态性分析[J].中外医学研究，2022，20(10)：4.)。叶鸣等人报道了4G/5G多态性与不良妊娠的相关性(叶鸣，方佳，赵磊，等.皖南地区MTHFR和PAI
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1基因多态性分布及与不良妊娠相关性研究[J].中国药业，2022，31(9)：65
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68.)。此外，PAI
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1基因4G/5G基因多态性还与冠心病相关(姜大钧，纪琳琳，孙鹏，等.PAI
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1基因多态性与冠心病的相关性研究[J].世界最新医学信息文摘(连续型电子期刊)，2018，18(92)：159.DOI：10.19613/j.cnki.1671
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3141.2018.92.076.)。
[0004]鉴于此，开发一种操作方便、成本低廉、灵敏度高的PAI
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1基因启动子4G/5G多态性检测方法具有重要的意义和广泛的临床应用价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是如何快速、准确和/或灵敏地检测PAI
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1基因4G/5G多态性。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了用于检测PAI
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1基因4G/5G多态性的组合物，所述组合物可包括引物F1、引物F2和引物R，所述引物F1为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子，所述引物F2为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子，所述引物R为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子。
[0007]所述引物F1和F2为正向引物，所述引物R为反向引物。
[0008]所述引物F1、引物F2和引物R用于特异性扩增含有PAI
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1基因4G/5G多态性位点(rs1799762)的PAI
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1基因片段。
[0009]所述PAI
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1基因片段的核苷酸序列可为SEQ ID No.6(SNP位点处为GGGG)或SEQ ID No.7(SNP位点处为GGGGG，即PAI
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1基因启动子区
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测PAI
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1基因4G/5G多态性的组合物，其特征在于，所述组合物包括引物F1、引物F2和引物R，所述引物F1为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子，所述引物F2为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子，所述引物R为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括探针，所述探针的核苷酸序列为SEQ ID No.4。3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述探针的5
’
端标记荧光基团，3
’
端标记淬灭基团。4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述探针的5
’
端标记FAM，3
’
端标记TAMRA。5.用于检测PAI
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1基因4G/5G多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1
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4中任一所述的组合物。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含阳性对照品，所述阳性对照品为下述任一种：C1)PAI
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1 4G/4G基因和PAI
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1 5G/5G基因；C2)PAI
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1 4G/4G基因片段和PAI
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1 5G/5G基因片段；C3)含有PAI
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1 4G/4G基因的重组载体和含有PAI
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1 5G/5G基因的重组载体；C4)含有PAI
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1 4G/4G基因片段的重组载体和含有PAI
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1 5G/5G基因片段的重组载体；所述PAI
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1 4G/4G基因和PAI
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1 4G/4G基因片段均含有PAI
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1基因4G/5G多态性位点中4G/4G多态性位点，所述PAI
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1 5G/5G基因和PAI
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1 5G/5G基因片段均含有PAI
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1基因4G/5G多态性位点中5G/5G多态性位点。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述PAI
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1 4G/4G基因片段为SEQ ID No.6所示的DNA分子或SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯俊林，李靖，唐伟评，
申请(专利权)人：北京中康博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：