一种用于神经母细胞瘤循环肿瘤细胞检测的细胞传感器制造技术

本发明专利技术公开了一种用于神经母细胞瘤循环肿瘤细胞检测的细胞传感器，涉及细胞传感器技术领域，其技术方案要点是：利用高导电性的金@乙炔黑纳米复合物以及高催化作用的氧化铈铂等纳米材料，以及高特异的SELXE技术及信号探针捕获等技术构建一个新型细胞传感器，用于神经母细胞瘤(NB)患者外周血循环肿瘤细胞(CTCs)的高特异性、高灵敏度检测。该细胞传感器不仅可以用于临床NB患者外周血CTCs检测，具有特异性高、灵敏度强、快速简便、成本较低等优点，同时还可以在不损伤CTCs活性的前提下，实现CTCs特异性富集回收与培养，有助于进一步进行细胞、分子、基因等层面的深入研究。基因等层面的深入研究。基因等层面的深入研究。

【技术实现步骤摘要】
一种用于神经母细胞瘤循环肿瘤细胞检测的细胞传感器


[0001]本专利技术涉及细胞传感器
，更具体地说，它涉及一种用于神经母细胞瘤循环肿瘤细胞检测的细胞传感器。

技术介绍

[0002]神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是儿童最常见外周神经系统肿瘤。NB年发病率约为0.3
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5.5/10万，仅次于白血病、淋巴瘤和脑瘤，占儿童肿瘤的7％
‑
8％，但其死亡率占儿童肿瘤死亡人数的10％
‑
15％。NB肿瘤部位隐匿，早期难以发现，具有原发灶不一、早期转移、肿瘤临床变异和生物学行为多样性的特点。临床分
Ⅰ‑Ⅳ
s期，因其恶性程度高，易发生转移等特点，诊断时以Ⅲ、Ⅳ期多见，预后较差，长期生存率仅为30％，严重危害儿童健康，是值得关注的儿童重要疾病。
[0003]长期以来，NB诊断缺乏特异性肿瘤标志物，无有效早期筛查指标，约70
‑
80％患者在确诊时已属晚期，诊治过程中容易被忽视。目前的治疗方式包括手术、化疗、放疗、造血干细胞移植及免疫维持治疗，然而对治疗后的疗效判定同样缺乏特异性分子生物学判读指标，NB复发转移常难以得到及时发现、早期干预和疗效的有效评估，严重影响患者的生存质量。
[0004]循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCells,CTCs)是一种新型肿瘤标志物，早期精准检测有利于对NB患者进行及时有效的诊断、干预与治疗。研究显示NB患者外周血CTCs显著增加，与临床分期及患者预后密切相关，但CTCs在癌症转移早期的血液中含量极少，故而开发一种能够对CTCs超灵敏、超特异检测的新策略就显得极其重要。现有技术中检测CTCs的方法主要有细胞学检测、荧光成像、免疫细胞化学技术、光纤阵列扫描术及逆转录聚合酶链式反应技术等，这些方法存在灵敏度不足、价格昂贵、耗时较长、易于出现假阴性等缺点，限制了其应用于临床，迫切需要一种实现对CTCs进行高性能检测的捕获策略。
[0005]近年来，随着纳米技术的飞速发展，多种多样的纳米材料被广泛应用于计算机、家电、环境保护、化工、纺织工业等行业，特别是在疾病诊疗方面，能明显地提高传感器的灵敏度，为发现和监测早期病变提供了强有力的保障。金属纳米材料氧化铈(CeO2)和铂(Pt)是球形纳米颗粒，不仅具有较大的比表面积、良好的导电性，而且具有很好的催化过氧化氢的类酶活性。现有技术中已经有采用纳米材料成功构建细胞传感器用于检测外周血CTCs的实例，但其传感器搭建过程需要进一步优化和简化、检测体系和检测过程有待完善，纳米材料残留消除不彻底。
[0006]除了灵敏度之外，特异性也是优良细胞传感器必不可少的一个特性。配体指数富集法系统演化(systematicevolutionofligandsby exponentialenrichment,SELEX)技术是一种高通量生物文库筛选技术，应用大容量的随机寡核苷酸文库，结合PCR体外扩增技术，以指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过反复的体外筛选、扩增，最终获得核酸适体。核酸适体与靶分子的结合和抗原与抗体作用相似，更具有分子量小、无免疫原性、靶标种类丰富，而且合成方法简单、重复性好、修饰灵活、便于长期贮存和常温运输等等。
[0007]CTCs检测能力的提高还需要高强度、高效率的捕获能力。现有细胞传感器大都面临着两个问题：第一，被捕获在电极表面的靶细胞体积太大，不仅形成明显的空间位阻，影响细胞本身被捕获的效率以及信号分子的结合效率；而且会大大影响电子的传递效率。第二，由于常规电极表面所能容纳的样本量是有限的(微升级)，远远达不到检测CTCs的极低浓度。
[0008]此外，CTCs检测完成后，需要收集这些细胞，并保持其活性，以便进行深入研究。目前基于纳米材料制备的细胞传感器，在检测完成后，回收的细胞中存在掺杂纳米材料杂质的问题，纳米材料的残留将影响细胞活性并且容易被细菌污染。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的是提供一种用于神经母细胞瘤循环肿瘤细胞检测的细胞传感器，能够快速、准确、灵敏、便捷地检测NB患者外周血CTCs，具有特异性高、灵敏度强、快速简便、成本较低等优点，同时还可以用于CTCs的特异性富集回收与培养，有助于进一步进行细胞、分子、基因等层面的深入研究。
[0010]本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种用于神经母细胞瘤循环肿瘤细胞检测的细胞传感器，所述细胞传感器通过结合磁珠的核酸适体、金@乙炔黑纳米复合物以及结合氧化铈铂纳米球的信号探针构建而成。
[0011]一种用于神经母细胞瘤循环肿瘤细胞检测的细胞传感器的构建方法包括以下4个步骤：
[0012]S1.筛选核酸适体；
[0013]S2.制备纳米材料；
[0014]S3.改良信号探针捕获模式；
[0015]S4.构建细胞传感器。
[0016]本专利技术进一步设置为：所述S1中采用SELEX技术筛选出与外周血CTCs细胞表面GD2特异性、结合效率最高的核酸适体，其具体操作如下：在体外化学合成一个单链寡核苷酸库，与GD2混合，在37℃下孵育使其充分结合后，洗掉未与GD2结合的核酸，随后分离与GD2结合的核酸分子，并以此核酸分子为模板进行PCR扩增；重复上述操作，将与GD2不结合或有低亲和力、中亲和力的DNA不断洗去，与GD2有高亲和力的DNA被分离出来，且纯度随SELEX过程的进行而增高，从p摩尔到n摩尔，直到占据库的90％以上。
[0017]本专利技术进一步设置为：所述制备纳米材料包括以下2个步骤：
[0018]1)制备金@乙炔黑纳米复合物：配置乙炔黑溶液，超声20min，反复3次，使其更好的分散，取出100mL分散好的乙炔黑溶液，向其中加入1mg的HAuCl4，搅拌沸腾15min，并迅速向其中添加2mL1％柠檬酸三钠，继续搅拌混合溶液15min，冷却至室温后，得到纳米复合物溶液，将其储存在4℃的棕色烧瓶中备用；
[0019]2)氧化铈铂纳米球的合成：合成过程在氩气保护下磁力搅拌中进行，将含有400μL0.1M柠檬酸钠溶液、400μL1.0M新制的NaBH4溶液和100μL0.5MCoCl2溶液的去离子水脱氧合成钴纳米粒子，在其中加入0.1M的氯铂酸，得到氧化铈铂纳米球，离心收集，用去离子水反复洗涤，加入10mLH2O制成纳米粒子悬液，向其中滴加1mL的0.1MCe(NO3)3，搅拌10min，快速加入1mL的0.2MNaOH水溶液，将溶液在70℃下加热1h，冷却到室温后，离心分离纯化样品。
[0020]本专利技术进一步设置为：所述改良信号探针捕获模式具体操作如下：配置适体与信号探针的混合溶液,其中适体的末端利用亲和素与生物素作为纽带结合磁珠，信号探针与氧化铈铂纳米球结合，在37℃恒温孵箱内，孵育1h，使二者充分杂交，利用磁场将二者合成的双链分离出来，备用；随后将其加入到靶细胞悬液中，在37℃恒温孵箱内，孵育1h，让靶细胞将适体最大程度地从双链中置换下来，释放信号探针，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于神经母细胞瘤循环肿瘤细胞检测的细胞传感器，其特征是：所述细胞传感器通过结合磁珠的核酸适体、金@乙炔黑纳米复合物以及结合氧化铈铂纳米球的信号探针构建而成。2.一种用于神经母细胞瘤循环肿瘤细胞检测的细胞传感器的构建方法，其特征是：包括以下4个步骤：S1.筛选核酸适体；S2.制备纳米材料；S3.改良信号探针捕获模式；S4.构建细胞传感器。3.根据权利要求2所述的一种用于神经母细胞瘤循环肿瘤细胞检测的细胞传感器的构建方法，其特征是：所述S1中采用SELEX技术筛选出与外周血CTCs细胞表面GD2特异性、结合效率最高的核酸适体，其具体操作如下：在体外化学合成一个单链寡核苷酸库，与GD2混合，在37℃下孵育使其充分结合后，洗掉未与GD2结合的核酸，随后分离与GD2结合的核酸分子，并以此核酸分子为模板进行PCR扩增；重复上述操作，将与GD2不结合或有低亲和力、中亲和力的DNA不断洗去，与GD2有高亲和力的DNA被分离出来，且纯度随SELEX过程的进行而增高，从p摩尔到n摩尔，直到占据库的90％以上。4.根据权利要求2所述的一种用于神经母细胞瘤循环肿瘤细胞检测的细胞传感器的构建方法，其特征是：所述制备纳米材料包括以下2个步骤：1)制备金@乙炔黑纳米复合物：配置乙炔黑溶液，超声20min，反复3次，使其更好的分散，取出100mL分散好的乙炔黑溶液，向其中加入1mg的HAuCl4，搅拌沸腾15min，并迅速向其中添加2mL1％柠檬酸三钠，继续搅拌混合溶液15min，冷却至室温后，得到纳米复合物溶液，将其储存在4℃的棕色烧瓶中备用；2)氧化铈铂纳米球的合成：合成过程在氩气保护下磁力搅拌中进行，将含有400μL0.1M柠檬酸钠溶液、400μL1.0M新制的NaBH4溶液和100μL0.5MCoCl2溶液的去离子水脱氧合成钴纳米粒子，在其中加入0.1M的氯铂酸，得到氧化铈铂纳米球，离心收集，用去离子水反复洗涤，加入10mLH2O制成纳米粒子悬液，向其中滴...

【专利技术属性】
技术研发人员：何晓燕，杨睿，刘南京，付虚怀，余朝文，王溪，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属儿童医院，
类型：发明
国别省市：