一种皮质醇检测试剂盒制造技术

本申请涉及一种皮质醇检测试剂盒。具体而言，本申请的6

【技术实现步骤摘要】
一种皮质醇检测试剂盒
[0001]本申请是2019年12月31日提交的中国专利申请《6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备皮质醇检测试剂中的用途》(申请号2019114041546)的分案申请。


[0002]本申请涉及生物检测领域，特别是涉及一种突变的酶6
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磷酸葡萄糖脱氢酶(简称G6PDH)及其在皮质醇检测试剂盒中的应用。

技术介绍

[0003]半抗原，某些小分子物质(分子量小于4000Da)，其单独不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，诱导免疫应答。这些小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性，它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。
[0004]半抗原能与对应抗体结合出现抗原
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抗体反应，又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖、类脂、激素、小分子药物都属于半抗原。如果用化学方法把半抗原与某种蛋白分子(载体)结合，会获得新的免疫原性，并能刺激动物产生相应的抗体。半抗原一旦与蛋白结合，就构成该蛋白质的一个抗原簇。一些比一般半抗原分子量小，但有特异结构的化学活性基团物质(如青霉素、磺胺剂等)，称为简单半抗原。
[0005]小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，多采用竞争模式。原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，显色愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。
[0006]皮质醇(Cortisol)结构式如下所示：
[0007][0008]皮质醇，亦称氢化可的松，又称氢皮质素或化合物F(compound F)，是从肾上腺皮质中提取出的是对糖类代谢具有最强作用的肾上腺皮质激素(属于糖皮质激素的一种)。
[0009]皮质醇是通过肾上腺皮质线粒体中的11β
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羟化酶的作用，由11
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脱氧皮质醇生成。皮质醇也可通过11
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β
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羟类固醇脱氢酶(11
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β
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hydroxysteroid dehydrogenase)的作用变成皮质素。
[0010]皮质醇在许多重要生理过程的调节中发挥着重要作用，包括能量代谢、维持电解
质和血压平衡、免疫调节、应激反应、细胞增殖和分化已经记忆调节和认知功能等等。血液中皮质醇主要与皮质类固醇结合球蛋白和白蛋白结合，游离的皮质醇只占3
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5％，且皮质醇浓度水平每天呈现周期性变化，前半夜达到最低，并在凌晨达到峰值。
[0011]血液中测量皮质醇主要用于库欣综合征导致的皮质醇分泌过多和艾迪生病导致的皮质醇缺乏等人类疾病，以及治疗监测(地塞米松抑制疗法和激素替代疗法)。
[0012]目前已知的皮质醇检测方法主要有：酶联免疫吸附法、化学发光免疫分析法、高效液相色谱法、气液色谱法、气相色谱法和质谱联用等。但这些检测方法均存在较多的缺陷，如化学发光尽管灵敏度较好，但需要配套的专用设备，投入使用成本较高不利于推广。在临床检测诊断过程中，以均相酶免疫法(EMIT)和胶乳增强免疫比浊法检测为主。
[0013]均相酶免疫测定的原理：在液体均相反应体系中，酶标记抗原(如G6PDH
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皮质醇)与非标记抗原(皮质醇)，竞争与定量的抗体(皮质醇抗体)进行结合，当抗体与非标记抗原结合越多，酶标记抗原释放的活性就越多，酶催化底物NAD+生成NADH就越多，在340nm波长下检测NADH的吸光度变化，即可推算出液体中皮质醇的含量。
[0014]现有的均相酶免疫测定法、胶乳凝集比浊法常常因制备工艺复杂、批间差大，应用受到一定限制。
[0015]现有技术中描述了一种皮质醇衍生物
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G6PDH偶联物及其制备方法：
[0016]1)将G6PDH室温溶解于含有Tris、MgCl2和NaCl的溶液中(pH＝9.0)；
[0017]2)加入NADH、葡萄糖6磷酸以及卡必醇；
[0018]3)再逐滴加入二甲基亚砜；
[0019]4)在无水状态下称取皮质醇衍生物，溶解于DMF中；使溶液温度降到
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2至
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8℃；加入三丁胺；
[0020]5)加入氯甲酸异丁酯，
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2至
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8℃搅拌30分钟；
[0021]6)将上述激活的皮质醇衍生物溶液逐滴加入到溶解的G6PDH溶液中，2至8℃搅拌过夜；
[0022]7)通过层析柱纯化步骤6)所得溶液，获得的最终产物为G6PDH
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皮质醇衍生物的偶联物(例如，但不限于CN105131105A中所述方法)。
[0023]然而，现有技术的方法依赖于对小分子药物自身所带反应基团进行的激活，之后再与酶进行反应。这样的策略难以保证小分子药物和酶之间的定向1：1反应，而导致批间差异大。

技术实现思路

[0024]鉴于本领域的需求，本申请提供了一种新型的6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体、及其在制备皮质醇检测试剂盒中的用途。
[0025]根据一些实施方案，提供了一种6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。区别于已有发表的专利US006090567A(Homogeneous immunoassays using mutant glucose
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phosphate dehydrogenases)的6磷酸葡萄糖脱氢酶的突变体，本申请的6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，其包含选自以下的突变：D306C、G426C、D375C。
[0026]根据一些实施方案，提供了一种6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，所述6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体是选自以下的序列所示：SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4。
[0027]根据一些实施方案，提供了一种多核苷酸，其编码本申请的6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。
[0028]根据一些实施方案，提供了一种表达载体，其包含本申请的多核苷酸。
[0029]根据一些实施方案，提供了一种宿主细胞，其包含本申请的表达载体。宿主细胞可以是原核(如细菌)或真核(如酵母)。
[0030]根据一些实施方案，提供了一种偶联物，其是本申请的6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比1：n偶联而成。
[0031]在一些实施方案中，n是1至50，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种皮质醇检测试剂盒，其包含：第一试剂，所述第一试剂包含：底物、皮质醇抗体、缓冲液；第二试剂，所述第二试剂包含：偶联物、缓冲液；任选地，校准品，所述校准品包含10mM至500mM缓冲液、0ng/mL至800ng/mL皮质醇；以及任选地，质控品，所述质控品包含10mM至500mM缓冲液、100ng/mL至500ng/mL皮质醇；所述种偶联物是6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与皮质醇衍生物按照摩尔比1：1偶联而成；所述皮质醇衍生物是式I所示：其中，m为0至20的整数，优选1至10的整数，优选1至6的整数；X选自以下的任一个：马来酰亚胺、溴乙酰基、乙烯基砜、氮丙啶；更优选地，X是马来酰亚胺；相较于野生型6
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磷酸葡萄糖脱氢酶，所述6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体包含D306C突变；所述6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体是SEQ ID No.2所示。2.根据权利要求1所述的皮质醇检测试剂盒，其包含：第一试剂，其包含：10mM至500mM，优选100mM至300mM缓冲液、5mM至50mM，优选10mM至20mM葡萄糖
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磷酸、5mM至50mM，优选10mM至20mM氧化型β
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烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、10ng/ml至10μg/ml，优选100ng/ml至500ng/ml的皮质醇抗体、0.1g/L至5g/L，优选1g/L至5g/L稳定剂、0.1g/L至5g/L，优选1g/L至5g/L表面活性剂、0.1g/L至5g/L，优选1g/L至5g/L防腐剂；第二试剂，其包含：10mM至500mM，优选100mM至300mM缓冲液、0.01μg/ml至10μg/ml，优选0....

【专利技术属性】
技术研发人员：封建新，张启飞，龚俊，王贵利，刘希，
申请(专利权)人：北京九强生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：