一种SF3B1基因K700E型突变的荧光PCR检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及生物医学技术领域，提供了一种SF3B1基因K700E型突变的荧光PCR检测方法及试剂盒，包括针对SF3B1基因K700E型突变的特异性引物及探针，引物组合包括SF3B1基因K700E型突变型引物组合和SF3B1基因K700E型野生型引物组合，所述检测方法包括S1.抽提待测样本的基因组DNA；S2.制备qPCR反应体系；S3.进行qPCR扩增；S4.计算突变丰度，检测突变型的引物不会扩增野生型样本，因此野生型样本背景干净，无底峰干扰，检测灵敏度能够达到0.1％，能够准确定量突变基因型拷贝数和野生基因型拷贝数，进而能够计算变异等位基因频率，检测对象的范围宽泛。泛。泛。

【技术实现步骤摘要】
一种SF3B1基因K700E型突变的荧光PCR检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物医学
，尤其涉及了一种SF3B1基因K700E型突变的荧光PCR检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]SF3B1基因编码产物为剪接子3B亚基1，参与pre
‑
mRNA剪接过程中内含子
‑
外显子连接的30个剪接位点的识别。SF3B1基因在肿瘤中经常发生突变，但其突变不会导致SF3B1表达下降，而是改变了其识别剪接位点的方式，导致外显子跳跃或内含子保留等问题，导致了数千种基因的紊乱剪接。例如SF3B1突变导致几种线粒体铁代谢基因的异常剪接，进而驱动MDS患者的环形铁粒幼细胞的形成。SF3B1在MDS中的突变频率为20％～30％，在MDS伴环状铁粒幼红细胞(MDS
‑
RS)亚型中的突变频率为80％。2017版WHO及2019版骨髓增生异常综合征中国诊断与治疗指南中提出将SF3B1基因突变作为MDS
‑
RS亚型的诊断标准之一。
[0003]SF3B1突变不仅在MDS和其他髓系/淋系肿瘤中常见，也见于许多实体瘤，如乳腺癌、胰腺癌、葡萄膜黑色素瘤和前列腺癌等。SF3B1突变以K700E型突变最为普遍。目前研究表明出现SF3B1基因K700E型突变的细胞因无法启动折叠的DNA复制叉以及无法进行同源重组(HR)修复，导致细胞中基因组不稳定性增加。但同时也发现发生SF3B1基因K700E型突变的肿瘤细胞表现出对DNA损伤性化疗药物(例如依托泊苷)和PARP抑制剂的敏感性增加，提示携带有SF3B1基因K700E型突变的患者可以采用特异性靶向治疗，尤其是毒性较小的PARP抑制剂。
[0004]目前SF3B1基因K700E型突变的检测方法主要有Sanger测序、二代测序、数字PCR(ddPCR)。测序虽有覆盖全面等优点，但因费时等问题不适应于临床常规检查；ddPCR最大的优势在于高灵敏度，可对目的基因进行绝对定量，但其通量有限，操作复杂，检测时间长；检测范围较窄；仪器设备及试剂昂贵使得商业化优势并不明显。相比之下，荧光定量PCR方法成熟，配套仪器试剂齐全，操作简单，成本较低，且检测灵敏度高特异性高，适用于大样本的临床检测。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中SF3B1基因K700E型突变检测方法的不足和实际需求，本专利技术提供了一种SF3B1基因K700E型突变的荧光PCR检测方法及试剂盒，克服了现有技术中F3B1基因K700E型突变检测方法灵敏度低，操作复杂，成本高的问题。
[0006]本专利技术第一方面提供了一种检测SF3B1基因K700E型突变的引物组合，包括针对SF3B1基因K700E型突变的特异性引物及探针，所述特异性引物及探针的核苷酸序列如下：
[0007]SF3B1基因K700E型正向引物：5
’‑
TTGGCGGATACCCTTCCATA
‑3’
；
[0008]SF3B1基因K700E型突变型反向引物：5
’‑
GTCTTGTGGATGAGCAGCGGG
‑3’
；
[0009]SF3B1基因K700E型野生型反向引物：5
’
[0010]‑
GAGAGAATCTGGATGATATTGTGTAAC
‑3’
；
[0011]SF3B1基因K700E型探针：5
’
FAM
‑
AAGGCAGCAATGGCCAAAGCACT
‑
TAMRA3
’
。
[0012]进一步，所述引物组合包括SF3B1基因K700E型突变型引物组合和SF3B1基因K700E型野生型引物组合；
[0013]所述SF3B1基因K700E型突变型引物组合包括SF3B1基因K700E型正向引物、SF3B1基因K700E型突变型反向引物和SF3B1基因K700E型探针；
[0014]所述SF3B1基因K700E型野生型引物组合包括SF3B1基因K700E型正向引物、SF3B1基因K700E型野生型反向引物和SF3B1基因K700E型探针。
[0015]第二方面提供了一种F3B1基因K700E型突变的荧光PCR检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0016]S1.抽提待测样本的基因组DNA；
[0017]S2.制备qPCR反应体系；
[0018]S3.进行qPCR扩增；
[0019]S4.计算突变丰度。
[0020]进一步，所述qPCR反应体系包括SF3B1基因K700E型突变型检测体系、SF3B1基因K700E型野生型检测体系。
[0021]进一步，所述SF3B1基因K700E型突变型检测体系包括SF3B1基因K700E型突变型引物组合；所述SF3B1基因K700E型野生型检测体系包括SF3B1基因K700E型野生型引物组合。
[0022]进一步，所述qPCR扩增反应条件为：50℃2min；95℃10min；95℃15s，60℃60s，45个循环；4℃保存。
[0023]进一步，所述SF3B1基因K700E型突变阳性的判断标准为当突变丰度≥0.2％时为阳性，所述检测方法的质控标准为SF3B1基因K700E型野生型检测体系的ct值＜30时为合格。
[0024]进一步，所述待测样本为包含待检测对象基因组DNA的样本。
[0025]第三方面提供了一种SF3B1基因K700E型突变的荧光PCR检测试剂盒，包括用于提取待测样本的基因组DNA的试剂和qPCR反应液，所述qPCR反应液分别为SF3B1基因K700E型突变型检测体系、SF3B1基因K700E型野生型检测体系的qPCR反应液；
[0026]所述qPCR反应液包括上述的SF3B1基因K700E型突变型引物组合和SF3B1基因K700E型野生型引物组合；
[0027]所述qPCR反应液还包括其他用于qPCR的扩增试剂；
[0028]所述qPCR反应液中的特异性引物的工作浓度为10μM，探针的工作浓度为10μM。
[0029]进一步，所述试剂盒还包括阳性对照品、弱阳性对照品、阴性对照品、空白对照品。
[0030]本专利技术的优点在于：
[0031]1)通过检测SF3B1基因K700E型突变，再配合标准曲线能够准确定量突变基因型拷贝数和野生基因型拷贝数，进而能够计算变异等位基因频率(Variant Allele Frequency,VAF)，即突变丰度；
[0032]2)引物探针针对SF3B1基因K700E型突变的基因型进行设计，检测突变型的引物不会扩增野生型样本，因此野生型样本背景干净，无底峰干扰；
[0033]3)该检测试剂盒及方法的检测灵敏度能够达到0.1％；
[0034]4)检测对象的范围宽泛，只要能从检测样本中抽提检测对象的基因组DNA即可，可
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测SF3B1基因K700E型突变的引物组合，其特征在于，包括针对SF3B1基因K700E型突变的特异性引物及探针，所述特异性引物及探针的核苷酸序列如下：SF3B1基因K700E型正向引物：5
’‑
TTGGCGGATACCCTTCCATA
‑3’
；SF3B1基因K700E型突变型反向引物：5
’‑
GTCTTGTGGATGAGCAGCGGG
‑3’
；SF3B1基因K700E型野生型反向引物：5
’‑
GAGAGAATCTGGATGATATTGTGTAAC
‑3’
；SF3B1基因K700E型探针：5
’
FAM
‑
AAGGCAGCAATGGCCAAAGCACT
‑
TAMRA3
’
。2.根据权利要求1所述的一种检测SF3B1基因K700E型突变的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括SF3B1基因K700E型突变型引物组合和SF3B1基因K700E型野生型引物组合；所述SF3B1基因K700E型突变型引物组合包括SF3B1基因K700E型正向引物、SF3B1基因K700E型突变型反向引物和SF3B1基因K700E型探针；所述SF3B1基因K700E型野生型引物组合包括SF3B1基因K700E型正向引物、SF3B1基因K700E型野生型反向引物和SF3B1基因K700E型探针。3.一种包括权利要求1
‑
2任一项所述的一种检测SF3B1基因K700E型突变的引物组合的SF3B1基因K700E型突变的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：S1.抽提待测样本的基因组DNA；S2.制备qPCR反应体系；S3.进行qPCR扩增；S4.计算突变丰度。4.根据权利要求3所述的一种SF3B1基因K700E型突变的荧光PCR检...

【专利技术属性】
技术研发人员：汝昆，张蕾，陈斌，蔺亚妮，
申请(专利权)人：天津见康华美医学诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：