本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一组生物标志物及相关检测试剂盒。本发明专利技术提供的生物标志物包含FOXD3基因、FOXI2基因、RASSF1A基因、SHOX2基因和SOX17基因的组合，所述标志物组合可用于肺癌诊断。基于所述标志物组合设计检测引物和探针，并进一步开发的试剂盒用于诊断肺癌和/或评估肺癌风险等。采用本发明专利技术所述的生物标志物可以避免全基因组测序，大大节约测序数据量，具有优良的检测敏感性和特异性，且成本低、深度高、对相关基因甲基化水平的检测更加准确。本发明专利技术为肺癌筛查、术后及预后评估提供新思路，并对阐明肺癌相关的分子机制具有重要意义。要意义。
【技术实现步骤摘要】
肺癌甲基化标志物、检测试剂盒及其应用
[0001]本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种肺癌甲基化标志物组合、检测试剂盒及其应用。
技术介绍
[0002]目前临床所使用肺部肿瘤筛查诊断方法主要是靠低剂量螺旋CT(LDCT)和胸部X射线影像学检查。除此之外，还有其他多种辅助手段帮助支持肺癌的诊断，如纤维支气管镜、痰液细胞学检查、肿瘤标志物检测等，但经长期研究发现，上述这些方法各有利弊，都分别存在费用高、投入大、敏感度低、漏诊率高、假阳性高、不能早期诊断的局限性，有的操作不便，易给患者造成痛苦和不便。因此，迫切需要敏感、特异的生物标志物。
[0003]近年来肺癌表观遗传学研究进展对肺癌的早期诊断和治疗具有深远的意义。有证据表明抑癌基因启动子CpG岛高度甲基化是基因失活的一个重要机制，不同基因的转录失活将影响细胞周期、DNA修复、细胞凋亡等，与癌症的发生发展有着密切联系。基因甲基化是指DNA分子上CpG双核苷中的胞嘧啶(C)在酶的作用下选择性地添加甲基形成5
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甲基胞嘧啶的过程。在肺癌患者中，基因启动子区的CpG岛甲基化是一种较为普遍的现象。目前已报道的肺癌相关的甲基化基因标志物尚具敏感度低(35.5％)和特异性低(73％)的缺陷，使之应用于临床检测存在一定的局限。甲基化基因标志物针对某一或某些癌症的敏感度高，表示相应癌症的漏诊率低；类似地，其特异性高则表示相应癌症的误诊率低。故可知，甲基化基因标志物检测的敏感度、特异性是衡量其参考价值大小的两项重要指标。
[0004]因此，对肺癌甲基化基因标志物进行进一步深入研究，开发高敏感度、高特异性的与肺癌相关的甲基化基因及其组合的检测试剂，从而为肺癌诊断的准确性提供更有效的手段，是当前甲基化基因标志物检测技术中亟待解决的问题。
技术实现思路
[0005]针对现有方法的局限性，本专利技术的目的在于提供一种肺癌甲基化标志物，并针对筛选出的肺癌甲基化标志物特定区域进行引物及探针设计，同时建立相应的检测体系，实现基于筛选出的肺癌甲基化标志物组合用于肺癌样本高准确性、高灵敏度和高特异性等的检测目的，为肺癌诊断提供有价值的参考信息。
[0006]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种肺癌甲基化标志物、检测试剂盒及其应用。
[0007]本专利技术的目的之一是提供一种肺癌甲基化标志物，其特征在于，其包含FOXD3基因、FOXI2基因、RASSF1A基因、SHOX2基因和SOX17基因的组合。
[0008]本专利技术的另一目的是提供用于检测如上所述的基因甲基化标志物的物质在制备肺癌诊断产品中的用途。
[0009]本专利技术的另一目的是提供一种肺癌诊断用检测物，其包含如上所述的基因甲基化标志物的特异性检测引物和/或特异性检测探针。
[0010]本专利技术的另一目的是提供如上所述的检测物在制备肺癌诊断产品中的应用。
[0011]本专利技术的另一目的是提供一种肺癌诊断产品，所述产品包括如上所述的检测物。
[0012]在一优选实施方式中，所述肺癌诊断产品为试剂盒，其包含如上所述的检测物。
[0013]如上所述，本专利技术肺癌甲基化标志物、检测试剂盒及其应用，具有以下有益效果：
[0014]本专利技术提供了具有优异性能的肺癌甲基化标志物及检测试剂盒，相对于已有的检测方法如荧光PCR检测方法、二代测序检测方法等，检测性能大幅提升，具有检测准确度、灵敏度和特异性高的特点，且具有易开展，便于临床推广，可用于液体活检，成本低，能够降低液体患者的就医成本等优势。
具体实施方式
[0015]以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本专利技术的精神下进行各种修饰或改变。
[0016]本专利技术的目的是提供更高效的肺部肿瘤相关甲基化标志物，提高肺部肿瘤早筛早诊效率，解决肺癌早诊率低，临床治疗负担重等问题。提供一组有效的肺部肿瘤甲基化标志物，并提供高效的标志物组合。
[0017]本专利技术利用荧光PCR检测技术，检测白膜层(其中大部分为白细胞)、肺癌组织相关标志物甲基化的情况。初步确认该标志物用于血液检测肺癌的潜能。理想的肺癌甲基化检测标志物应该具备以下特征：
[0018](1)白膜层DNA甲基化水平低；
[0019](2)肺癌组织DNA甲基化水平高。
[0020]甲基化标志物检测采用甲基化特异PCR(MSP)来进行，MSP的基本原理是在检测中，只有甲基化的序列模板产生扩增信号，而非甲基化的序列模板不产生扩增信号。该方法可通过引物或者探针设计甲基化特异序列来实现，也可以同时设计甲基化特异的引物、探针对来实现。其主要步骤包括：
[0021]1)根据标志物序列，在适合进行MSP的检测区段(通常为CpG富集区域)，设计检测引物和探针；
[0022]2)进行白膜层和肺癌组织样本的核酸提取；
[0023]3)对核酸进行亚硫酸氢盐处理，使未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶维持序列不变；
[0024]4)进行荧光PCR检测。
[0025]经白膜层和组织样本检测，满足上述特征的标志物，证明其存在通过血液来检测肺癌的潜能。然后在血浆样本中，对这些标志物进行验证，检测样本包括对照组、肺癌组以及肺部结节、肺部炎症干扰人群等，以分析这些标志物的参考水平及标志物组合性能。
[0026]因单个样本血浆游离DNA有限，故进行荧光PCR检测时，可先对靶点进行预扩增，以使最少量的DNA能够检测尽可能多的甲基化位点。其主要步骤包括：
[0027]1)血浆样本的核酸提取；
[0028]2)对核酸进行亚硫酸氢盐处理，使未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，而甲基化的
胞嘧啶维持序列不变；
[0029]3)进行靶点的预扩增及稀释；
[0030]4)进行荧光PCR检测。
[0031]本专利技术人通过大量探索性研究，提供了一组用于诊断肺癌的生物标志物，其包含FOXD3基因、FOXI2基因、RASSF1A基因、SHOX2基因和SOX17基因的组合。所述生物标志物具有优良的检测敏感性和特异性，能解决当前肺癌(包括肺腺癌(LUAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC))诊断准确性、灵敏度、特异性不高等的问题，在此基础上完成了本专利技术。
[0032]本专利技术提供了一组用于诊断肺癌的生物标志物，其包含FOXD3基因、FOXI2基因、RASSF1A基因、SHOX2基因和SOX17基因的组合。具体包含所述FOXD3基因的CpG岛或FOXD3基因的启动子的CpG岛、FOXI2基因的CpG岛或FOXD3基因的启动子的CpG岛、RASSF1A基因的CpG岛或RASSF1A基因的启动子的CpG岛、SHOX2基因的CpG岛或SHOX2基因的启动子的CpG岛，以及SOX17基因的CpG岛或SOX17基因的启动子的CpG岛的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于肺癌诊断的基因甲基化标志物，其特征在于，其包含FOXD3基因、FOXI2基因、RASSF1A基因、SHOX2基因和SOX17基因的组合。2.如权利要求1所述的甲基化标志物，其特征在于，其包含所述FOXD3基因的CpG岛或FOXD3基因的启动子的CpG岛、FOXI2基因的CpG岛或FOXI2基因的启动子的CpG岛、RASSF1A基因的CpG岛或RASSF1A基因的启动子的CpG岛、SHOX2基因的CpG岛或SHOX2基因的启动子的CpG岛，以及SOX17基因的CpG岛或SOX17基因的启动子的CpG岛的组合。3.如权利要求1所述的甲基化标志物，其特征在于，所述FOXD3基因的CpG岛或FOXD3基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr1:63785908
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63785999的序列，或其活性片段；所述FOXI2基因的CpG岛或FOXI2基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr10:129534759
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129534851的序列，或其活性片段；所述RASSF1A基因的CpG岛或RASSF1A基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr3:50378061
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50378154的序列，或其活性片段；所述SHOX2基因的CpG岛或SHOX2基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr3:157821339
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157821429的序列，或其活性片段；所述SOX17基因的CpG岛或SOX17基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr8:55370987
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55371098的序列，或其活性片段。4.用于检测如权利要求1～3任一项所述的甲基化标志物的物质在制备肺癌诊断产品中的用途。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，通过PCR扩增反应检测各标志物基因；设定每个基因的Ct阳性判读区间，当任一基因阳性即将待测样本判读为阳性；所有基因均为阴性时，将待测样本判读为阴性；其中，所述各基因的阳性判读区间为，FOXD3基因：Ct≤26.02，FOXI2基因：Ct≤23.26，RASSF1A基因：Ct≤23.43，SHOX2...
【专利技术属性】
技术研发人员：李为民，汪周峰，王辉，张文庚，李小杰，刘蕊，
申请(专利权)人：江苏鹍远生物科技股份有限公司成都华西精准医学产业技术研究院有限公司江苏鹍远生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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