一种膀胱癌快速检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种膀胱癌快速检测试剂盒。包括检测HIST1H4F基因和SOX1

【技术实现步骤摘要】
一种膀胱癌快速检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及甲基化检测
，具体地，涉及一种膀胱癌快速检测试剂盒。

技术介绍

[0002]目前，膀胱癌的主要诊断方法包括影膀胱镜检查、尿脱落细胞学检查和荧光原位杂交等。其中，膀胱镜检查结合活检组织病理为膀胱镜诊断的金标准，但该方法属于有创性检查且价格昂贵，患者依从性低。影像学检查对千微小病灶的诊断能力有限，尿脱落细胞学检查的灵敏度低，荧光原位杂交方法检测膀胱癌的敏感度高但特异性相对较低，尚未在临床上广泛应用。
[0003]近些年甲基化检测被广泛应用于膀胱癌的早期筛查，目前膀胱癌甲基化检测多为亚硫酸氢盐转化法。亚硫酸氢盐可将非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，后者经PCR扩增转变成胸腺嘧啶而产生T：A配对，而甲基化的胞嘧啶则不显示结构变化，通过亚硫酸氢盐转化后DNA包含的甲基化信息就转化为DNA序列的差异。由此发展了多种膀胱癌甲基化检测方法，如亚硫酸氢盐测序法、焦磷酸测序、甲基化特异性PCR和实时甲基化特异性PCR等。但是，亚硫酸氢盐转化法存在下列缺点：
①
转化条件较为剧烈，可能会造成DNA降解从而影响后续检测的灵敏度；
②
操作繁琐，转化后还需纯化，可能造成DNA损失；
③
可能出现转化不完全的情况，从而影响后续检测的准确性；
④
未甲基化的胞嘧啶占人类基因组中总胞嘧啶的95％，未甲基化胞嘧啶完全转化为胸腺嘧啶将严重降低序列复杂性，从而降低了序列特异性并增加后续特异性检测的难度。因此，找到一种灵敏度高、特异性好、反应温和、操作便捷的甲基化分析方法，对膀胱癌的早期诊断、治疗和预后监测具有非常重要的现实意义。
[0004]甲基化敏感型限制性内切酶能够特异性识别酶切靶标并进行酶切，当酶切位点的胞嘧啶呈甲基化时无法进行酶切，因此能够将甲基化DNA同非甲基化DNA进行区分，将非甲基化的靶标序列进行充分碎片化，而保留完整状态的甲基化序列作为PCR和qPCR的模板。甲基化敏感型限制性内切酶检测方法，避免了使用亚硫酸氢盐转化，不会破坏核酸的完整程度，但是仍然面临着需要纯化回收酶切产物从而损失核酸的问题。除此之外，先酶切后PCR的过程也具有耗时长，易污染等缺陷，且酶切不完全也会导致检测产生假阳性。
[0005]膀胱肿瘤细胞容易从膀胱组织脱落，因此膀胱肿瘤患者的尿液样本包含大量脱落的病变细胞，这是尿液样本作为膀胱癌检测的物质基础。SOX1
‑
OT为SOX1基因的重叠转录本，对于细胞胚胎发育、细胞增殖状态、细胞调控的稳态维持有重要影响。HIST1H4F是组蛋白基因之一，对于形成和维持异染色质的结构、基因组印迹、DNA修复、X染色质的失活和转录等调控方面具有关键作用。SOX1
‑
OT和HIST1H4F基因特定位点的甲基化水平在膀胱癌组织中显著高于正常组织。目前市场上尚无使用甲基化敏感型限制性内切酶技术同步检测SOX1
‑
OT和HIST1H4F基因甲基化的试剂盒。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种膀胱癌快速检测试剂盒。通
过调整酶切扩增缓冲液的组分,使酶切和PCR扩增处于同一体系中,以实现尿沉渣细胞DNA甲基化程度的快速检测，且检测结果特异性和灵敏度更高。
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种检测膀胱癌的引物探针组合。
[0008]本专利技术的第二个目的是提供所述引物探针组合在制备检测膀胱癌的试剂盒中的应用。
[0009]本专利技术的第三个目的是提供一种检测膀胱癌的试剂盒。
[0010]为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：一组检测膀胱癌的引物探针组合，包括检测HIST1H4F基因和SOX1
‑
OT基因的引物和探针，检测HIST1H4F基因的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，检测HIST1H4F基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；检测SOX1
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OT基因的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，检测SOX1
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OT基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；所述HIST1H4F基因在NCBI上的Gene ID为319157，所述SOX1
‑
OT基因在NCBI上的Gene ID为100505996。
[0011]进一步地，所述引物探针组合中含包括检测B2M内参基因的引物和探针，检测B2M内参基因的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示，检测B2M内参基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；所述B2M内参基因在NCBI上的Gene ID为567。
[0012]进一步地，所述检测HIST1H4F基因的探针的5
’
端的荧光基团为FAM，3
’
端的荧光淬灭基团为BHQ1；所述检测SOX1
‑
OT基因的探针的5
’
端的荧光基团为VIC，3
’
端的荧光淬灭基团为MGB。
[0013]进一步地，所述检测B2M内参基因的探针的5
’
端的荧光基团为CY
‑
5，3
’
端的荧光淬灭基团为BHQ2。
[0014]所述引物探针组合在制备检测膀胱癌的试剂盒中的应用。
[0015]一种检测膀胱癌的试剂盒，所述试剂盒中含有所述的引物探针组合。
[0016]进一步地，所述引物和探针的浓度可以为10～100 μM。
[0017]进一步地，所述引物和探针的浓度为100 μM。
[0018]进一步地，检测HIST1H4F基因的上下游引物的用量可以为0.08～0.15 μL。
[0019]进一步地，检测HIST1H4F基因的上下游引物的用量都为0.11 μL。
[0020]进一步地，检测HIST1H4F基因的探针的用量可以为0.04～0.08 μL。
[0021]进一步地，检测HIST1H4F基因的探针的用量都为0.08 μL。
[0022]进一步地，检测SOX1
‑
OT基因的上下游引物的用量可以为0.08～0.15 μL。
[0023]进一步地，检测SOX1
‑
OT基因的上下游引物的用量都为0.12 μL。
[0024]进一步地，检测检测SOX1
‑
OT基因的探针的用量可以为0.03～0.06 μL。
[0025]进一步地，检测检测SOX1
‑
OT基因的探针的用量都为0.06 μL。
[0026]进一步地，检测B2M内参基因的上下游引物的用量可以为0.10～0.20 μL。
[0027]进一步地，检测B2M内参基因的上下游引物的用量都为0.12 μL。
[0028]进一步地，检测B2M本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测膀胱癌的引物探针组合，其特征在于，包括检测HIST1H4F基因和SOX1
‑
OT基因的引物和探针，检测HIST1H4F基因的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，检测HIST1H4F基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；检测SOX1
‑
OT基因的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，检测SOX1
‑
OT基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；所述HIST1H4F基因在NCBI上的Gene ID为319157，所述SOX1
‑
OT基因在NCBI上的Gene ID为100505996。2.根据权利要求1所述引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合中含包括检测B2M内参基因的引物和探针，检测B2M内参基因的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示，检测B2M内参基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；所述B2M内参基因在NCBI上的Gene ID为567。3.根据权利要求1所述引物探针组合，其特征在于，所述检测HIST1H4F基因的探针的5
’
端的荧光基团为FAM，3
’
端的荧光淬灭基团为BHQ1；所述检测SOX1
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：黄玄贺，葛毅媛，李菲，谢龙旭，王书霞，郭奕轩，
申请(专利权)人：汕头凯普医学检验实验室有限公司广东凯普生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：