一种对人iPSCs进行基因编辑制备神经干细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种对人iPSCs进行基因编辑制备神经干细胞的方法、由该方法得到的神经干细胞以及其培养或者维持神经干性方法。通过敲除人iPSCs BCOR的MLLT3binding、ANK repeats、PCGF1

【技术实现步骤摘要】
一种对人iPSCs进行基因编辑制备神经干细胞的方法


[0001]本专利技术涉及一种对人iPSCs进行基因编辑制备神经干细胞的方法。

技术介绍

[0002]NSCs(Neural Stem Cells,神经干细胞)具有自我复制及分化为多种神经元和神经胶质细胞的能力，因而在体外疾病模型研究，药物筛选，再生医学领域都有巨大的应用价值。目前NSCs的获得方式主要有三种：从原代组织中分离获得，从体细胞转分化获得，从多能干细胞诱导分化获得。从人多能干细胞诱导获得尤其是从人iPSCs诱导分化获得NSCs具有细胞来源不受限制，并可进行自体移植等优点。以往的神经分化会经历多能干细胞(Pluripotent Stem Cell,PSC)的聚集或拟胚体的形成，而这个过程易导致不同批次实验之间的差异(Tao and Zhang,2016)。传统的解决方案是通过加入SB431542和Noggin来抑制SMAD依赖的TGFβ(Transforming growth factor beta)和BMP信号通路，进而阻止额外的胚体和中胚层组织的分化，这种方法的诱导效率可达到80％左右(Chambers et al.,2009)。将iPSCs诱导成NSCs普遍的方法是加入小分子化合物的NSC诱导培养基进行诱导，而这种方法不能完全将iPSCs转化为NSCs，NSCs细胞异质性大，有成瘤风险等缺点。
[0003]目前，由人iPSCs诱导分化获得的NSCs在传代培养中需要通过特定的培养基维持NSCs的特性。不同于传统的NSCs诱导和维持方法，我们通过敲除iPSCs的PLSCR1基因以及编码BCOR的MLLT3 binding、ANK repeats、PCGF1
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interacting PUFD结构域序列(BCOR
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MAP)获得的NSCs，仅需要使用iPSCs培养基即可维持其NSCs特性不变，具有纯度高，细胞异质性低、增殖能力强、可在体外长期培养以及不易发生自发分化等优点。
[0004]从人体组织中分离获得NSCs的方法具有来源受限，分离出的NSCs异质性大，数量及扩增能力有限等缺点。从体细胞转分化获得NSCs的方法，由于体细胞增殖能力比较弱，增殖代数有限，细胞数量会受到限制，转分化效率比较低。利用商业化的添加小分子化合物或蛋白因子的培养基获得的NSCs具有异质性较高，有自发分化及成瘤风险等缺点。此外，诱导和维持NSCs的培养基需要添加不同组分的小分子化合物或蛋白因子，限制了NSCs的基础研究及临床应用。因此，传统方法中，培养基的成分对于iPSCs诱导为NSCs的效率及其神经干性维持具有关键作用。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种对人iPSCs进行基因编辑制备神经干细胞的方法，本专利技术还提供了由该方法得到的神经干细胞以及其培养或者维持神经干性方法。通过敲除人iPSCs BCOR的MLLT3 binding、ANK repeats、PCGF1
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interacting PUFD结构域(BCOR
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MAP)编码序列及PLSCR1基因，获得一种新型NSCs，命名为2K
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iNSCs。与传统方法相比，2K
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iNSCs诱导和维持不依赖添加小分子化合物或蛋白因子的NSCs培养基，仅在iPSCs培养基中即可持续传代并维持其神经干性。本专利技术还提供了一种用于敲除iPSCs的BCOR
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MAP、PLSCR1基因的sgRNA、质粒及其应用。
[0006]为实现上述目的，所采取的技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种用于敲除iPSCs的BCOR
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MAP、PLSCR1基因的sgRNA，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO:1
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SEQ ID NO:4所示。BCOR
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MAP是指BCOR的MLLT3 binding、ANK repeats和PCGF1
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interacting PUFD结构域。
[0008]本专利技术提供了一种用于敲除iPSCs的BCOR
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MAP、PLSCR1基因的质粒，所述质粒是将上述所述的sgRNA连接到基础质粒上而得到的。
[0009]优选地，所述基础质粒为PX330质粒。
[0010]本专利技术提供了上述所述的sgRNA或上述所述的质粒在制备神经干细胞中的应用。
[0011]本专利技术提供了一种对人iPSCs进行基因编辑制备神经干细胞的方法，所述方法是将人iPSCs的BCOR
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MAP、PLSCR1基因敲除而得到所述NSCs。
[0012]优选地，所述人iPSCs的BCOR
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MAP、PLSCR1基因敲除是采用上述所述的sgRNA或上述所述的质粒进行的。
[0013]本专利技术提供了一种对人iPSCs进行基因编辑制备神经干细胞的方法，包含以下步骤：
[0014](1)将上述所述的sgRNA连接到基础质粒上；
[0015](2)将构建好的质粒转入人iPSCs中，用hiPSCs培养基进行培养；
[0016](3)用Puromycin对所述步骤(3)获得的细胞进行筛选；
[0017](4)挑取单克隆并鉴定BCOR
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MAP和PLSCR1基因是否被敲除，筛选BCOR
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MAP和PLSCR1基因被敲除的细胞，得到NSCs。
[0018]优选地，所述步骤(4)还包括检测BCOR
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MAP和PLSCR1基因被敲除的细胞是否表达NSC标志物，挑选表达NSC标志物的细胞，从而得到NSCs。
[0019]优选地，所述步骤(1)中基础质粒为PX330质粒；所述步骤(2)中转入方式为电转；所述步骤(2)中人iPSCs为培养状态良好的人iPSCs；所述步骤(2)中hiPSCs培养基是mTesR1培养基。
[0020]本专利技术提供了一种神经干细胞，所述神经干细胞是由上述所述的方法制备而成的。
[0021]本专利技术提供了一种上述所述的神经干细胞的培养或者维持神经干性方法，所述方法包括采用hiPSCs培养基培养所述神经干细胞。
[0022]优选地，所述hiPSCs培养基是mTesR1培养基。
[0023]有益效果：
[0024]本专利技术提供了一种对人iPSCs进行基因编辑制备神经干细胞的方法以及由该方法得到的神经干细胞NSCs,且该NSCs不依赖传统的NSC培养基，仅在hiPSCs培养基(如mTesR1培养基)中培养即可，可在hiPSCs培养基中进行多次传代并保持其特性不变。这种细胞将来可以用于构建神经细胞疾病模型，用于神经系统疾病的治疗等。
附图说明
[0025]图1：本专利技术的流程示意图；
[0026]图2：BCOR及PLSCR1基因CRISPR
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Cas9切割位点示意图；
[0027]图3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于敲除iPSCs的BCOR
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MAP和PLSCR1基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO:1
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SEQ ID NO:4所示。2.一种用于敲除iPSCs的BCOR
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MAP和PLSCR1基因的质粒，其特征在于，所述质粒是将如权利要求1所述的sgRNA连接到基础质粒上而得到的；优选地，所述基础质粒为PX330质粒。3.如权利要求1所述的sgRNA或如权利要求2或3所述的质粒在制备神经干细胞中的应用。4.一种对人iPSCs进行基因编辑制备神经干细胞的方法，其特征在于，所述方法是将人iPSCs的BCOR
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MAP和PLSCR1基因敲除而得到所述NSCs。5.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述人iPSCs的BCOR
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MAP、PLSCR1基因敲除是采用如权利要求1所述的sgRNA或如权利要求2或3所述的质粒进行的。6.一种对人iPSCs进行基因编辑制备神经干细胞的方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)将如权利要求1所述的sgRNA连接到基础质粒上...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵凌，商必志，赵鸣雷，
申请(专利权)人：中山大学中山眼科中心，
类型：发明
国别省市：