一种酶转化法生产β-烟酰胺单核苷酸的方法技术

本申请涉及药物制备技术领域，具体公开了一种酶转化法生产β

【技术实现步骤摘要】
一种酶转化法生产
β
‑
烟酰胺单核苷酸的方法


[0001]本申请涉及药物制备
，更具体地说，它涉及一种酶转化法生产β
‑
烟酰胺单核苷酸的方法。

技术介绍

[0002]β
‑
烟酰胺单核苷酸(NMN)是哺乳动物体内一种关键性辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的前体物质，其主要功能由NAD+体现，参与许多关键过程，包括能量代谢，基因表达和DNA修复。而NAD+是细胞能量代谢和氧化应激适应性反应的关键辅酶，NAD+水平对于维持线粒体的稳态、生物体的代谢、器官和组织的正常功能，以及延缓衰老具有重要意义。
[0003]目前，通常采用烟酰胺核糖激酶(NRK)，以烟酰胺核糖(NR)和三磷酸腺苷(ATP)为原料，在缓冲溶液中进行反应，得到β
‑
烟酰胺单核苷酸(NMN)，而过程中的反应温度通常为30
‑
45℃。但上述工业生产中，往往提升反应温度则能够加快反应速率和缩短反应时间，从而获得较大的生产，但同时当反应的温度过高时，则会导致酶的整体活性受到损伤，往往会起到反效果。因此，为寻求上述优势的体现，往往通过定向突变方法提高烟酰胺核糖激酶的热稳定性及酶活性，以此来提高β
‑
烟酰胺单核苷酸生产的工业应用性。
[0004]针对上述中的相关技术，专利技术人认为，定向突变方法操作较为复杂，且需要通过核苷酸序列测定，以确证有无其它突变发生，导致获得的烟酰胺核糖激酶突变体成本较高，在较大生产中很难实现大规模应用，因此，目前亟需提出一种方案以解决上述技术问题。

技术实现思路

[0005]为了使β
‑
烟酰胺单核苷酸能够在较高温度下应用烟酰胺核糖激酶进行高效生产，本申请提供一种酶转化法生产β
‑
烟酰胺单核苷酸的方法。
[0006]本申请提供的一种酶转化法生产β
‑
烟酰胺单核苷酸的方法，采用如下的技术方案：一种酶转化法生产β
‑
烟酰胺单核苷酸的方法，包括以下步骤：(1)将烟酰胺核糖和三磷酸腺苷按比例加入到缓冲溶液中，得到反应溶液；(2)在步骤(1)的反应溶液中加入烟酰胺核糖激酶，混合均匀后，再加入烟酰胺核糖激酶重量3
‑
5倍的混合保护助剂，混合均匀后，升温至60
‑
70℃进行反应，得到产物混料；(3)将步骤(2)中产物混料进行过滤，经大孔树脂吸附后，真空干燥，再进行重结晶，即可得到β
‑
烟酰胺单核苷酸；所述混合保护助剂由包含壳聚糖、多羟基化合物的原料组成，且壳聚糖、多羟基化合物的重量比为1:(1.4
‑
2.1)。
[0007]通过采用上述技术方案，壳聚糖的耐热性优异，其分子中的羟基和氨基可形成活泼界面，对蛋白质有显著的亲和力，可将烟酰胺核糖激酶通过离子键、氢键及范德华力进行吸附固定，充当良好的载体作用。高温会导致烟酰胺核糖激酶分子内氢键和水分子相互作用被破坏，使得烟酰胺核糖激酶的构像发生变化，进而产生失活，而多羟基化合物则能够利
用羟基替代水分子与烟酰胺核糖激酶结合，阻止烟酰胺核糖激酶分子空间结构发生变化，以提高烟酰胺核糖激酶应用时的热稳定性。同时，将壳聚糖、多羟基化合物按特定比例范围用作混合保护助剂时，其相互间能够在烟酰胺核糖激酶分子空隙中和酶分子周围形成支撑和保护结构，且这种结构在较高温度下不易被破坏，能够有效维护烟酰胺核糖激酶构像的稳定。因此，本申请在生产β
‑
烟酰胺单核苷酸的过程中，只取用常规烟酰胺核糖激酶即可，无需采用定向突变得到的烟酰胺核糖激酶突变体，也能够在60
‑
70℃的较高温度下进行高效生产，且混合保护助剂的应用相比于定向突变得到的烟酰胺核糖激酶突变体，成本较低，适用于大规模的工业化生产。
[0008]优选的，所述壳聚糖、多羟基化合物的重量比为1:1.9。
[0009]通过采用上述技术方案，上述重量比的壳聚糖、多羟基化合物，相互间能够起到较为优异的配合效果，使混合保护助剂在较高温度的环境中，对烟酰胺核糖激酶的保护效果最为优异，使β
‑
烟酰胺单核苷酸在生产过程中更加高效，大规模工业化生产中表现较为突出。
[0010]优选的，所述多羟基化合物为山梨醇、甘露醇、甘油和海藻糖中的一种或几种的组合物。
[0011]通过采用上述技术方案，上述多羟基化合物在应用过程中，均能够发挥出优异稳定的作用，并与壳聚糖间复配发挥出稳定的复配效果，进而给烟酰胺核糖激酶的热稳定性带来优异的提升效果，以达到实现β
‑
烟酰胺单核苷酸能够在较高温度下应用烟酰胺核糖激酶进行高效生产的目的。
[0012]优选的，所述多羟基化合物由山梨醇和甘露醇组成，且山梨醇和甘露醇的重量比为1:(0.8
‑
1.2)。
[0013]通过采用上述技术方案，选用山梨醇和甘露醇组成多羟基化合物进行使用，还能够使烟酰胺核糖激酶内部和外部的氢键数目增多，而氢键对维持蛋白质结构起到重要作用，因此，上述多羟基化合物能够更好地保护烟酰胺核糖激酶的空间结构，进而使烟酰胺核糖激酶的热稳定性得到较为优异的提升。
[0014]优选的，所述混合保护助剂中还包括无机盐离子复配物，且无机盐离子复配物、壳聚糖、多羟基化合物的重量比为(0.2
‑
0.5):1:(1.4
‑
2.1)。
[0015]通过采用上述技术方案，无机盐离子的使用，能够结合烟酰胺核糖激酶分子中的配对阴离子，降低分子内静电排斥作用，并提供适宜的化学微环境，对烟酰胺核糖激酶的氢键、盐键和疏水作用产生正向影响，进而辅助壳聚糖、多羟基化合物能够在应用过程中充分发挥作用，以进一步提高烟酰胺核糖激酶在较高温度下的稳定性，有利于实现β
‑
烟酰胺单核苷酸更加高效的生产。
[0016]优选的，所述无机盐离子复配物由硫酸钙和硫酸镁组成，且硫酸钙和硫酸镁的重量比为1:(0.5
‑
1.5)。
[0017]通过采用上述技术方案，硫酸钙和硫酸镁组成的无机盐离子复配物，通过钙离子、镁离子和硫酸根离子的引入，能够充分作用于烟酰胺核糖激酶，对该酶的活力和热稳定性作用显著。
[0018]优选的，所述无机盐离子复配物、壳聚糖、多羟基化合物的重量比为0.3:1:1.9。
[0019]通过采用上述技术方案，上述重量比的无机盐离子复配物、壳聚糖、多羟基化合物
能够在应用过程中表现出较为优异的配合效果，使β
‑
烟酰胺单核苷酸能够在较高温度下应用烟酰胺核糖激酶进行高效生产，整体表现较为优异。
[0020]优选的，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，且磷酸盐缓冲溶液的pH为7.0
‑
8.5。
[0021]通过采用上述技术方案，上述缓冲溶液的选择以及pH的控制，能够使烟酰胺核糖和三磷酸腺苷在烟酰胺核糖激酶的作用下充分反应，并有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶转化法生产β
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烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将烟酰胺核糖和三磷酸腺苷按比例加入到缓冲溶液中，得到反应溶液；（2）在步骤（1）的反应溶液中加入烟酰胺核糖激酶，混合均匀后，再加入烟酰胺核糖激酶重量3
‑
5倍的混合保护助剂，混合均匀后，升温至60
‑
70℃进行反应，得到产物混料；（3）将步骤（2）中产物混料进行过滤，经大孔树脂吸附后，真空干燥，再进行重结晶，即可得到β
‑
烟酰胺单核苷酸；所述混合保护助剂由包含壳聚糖、多羟基化合物的原料组成，且壳聚糖、多羟基化合物的重量比为1:（1.4
‑
2.1）。2.根据权利要求1所述的酶转化法生产β
‑
烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：所述壳聚糖、多羟基化合物的重量比为1:1.9。3.根据权利要求1所述的酶转化法生产β
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烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：所述多羟基化合物为山梨醇、甘露醇、甘油和海藻糖中的一种或几种的组合物。4.根据权利要求3所述的酶转化法生产β
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烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：所述多羟基化合物由山梨醇和甘露醇组成，且山梨醇和甘露醇的重量比为1:（0.8
‑
1.2）。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：楼秀余，吴锦青，戴小燕，李志国，
申请(专利权)人：上海舒泽生物科技研究所，
类型：发明
国别省市：