一种TAMV核蛋白多抗原表位串联重组蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物疫苗和微生物的检测与诊断技术领域，尤其是涉及一种TAMV核蛋白多抗原表位串联重组蛋白及其应用。本发明专利技术通过改良生物合成肽法筛选鉴定NP的B细胞抗原精细表位，通过柔性片段串联多抗原表位并多拷贝(NP

【技术实现步骤摘要】
一种TAMV核蛋白多抗原表位串联重组蛋白及其应用


[0001]本专利技术涉及生物疫苗和微生物的检测与诊断
，尤其是涉及一种TAMV核蛋白多抗原表位串联重组蛋白及其应用。

技术介绍

[0002]Tamdy病毒(TAMV)于1971～1974年首次自土库曼斯坦和乌兹别克斯坦的璃眼蜱(Hyalomma asiaticum)中分离得到，随后从中亚和外高加索地区多个国家包括亚美尼亚、哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦、土耳其等国采集的璃眼蜱中分离得到了47株TAMV。中国首次报道于2018年从新疆地区双峰驼身上的亚洲璃眼蜱中分离鉴定出一株TAMV毒株(XJ01/TAMV/China/2018)，实验表明该TAMV分离株可以在非洲绿猴肾细胞系进行增殖，接种细胞出现病变效应，推测TAMV存在借助蜱虫媒介感染哺乳动物的风险，对人类健康具有潜在的威胁。
[0003]基于对不同亚种TAMV全长基因组序列比对及系统发育分析，TAMV归类于布尼亚病毒目(Bunyavirales)、内罗病毒科(Nairoviridae)、正内罗病毒属(Orthonarivirus)。该病毒属包含许多众所周知的高致病性病原体，如发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)和汉坦病毒(HTNV)。此外，还包括许多对人类和其他哺乳动物具有严重威胁病原体，如克里米亚
‑
刚果出血热病毒(CCHFV)、内罗毕绵羊病病毒(NSDV)、杜格贝病毒(DUGV)和塔城蜱病毒1型(TcTV
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1)。TAMV属于Tamdy基因型，该基因型还包括来自豪猪血蜱的布拉纳病毒(BURV)、边缘革蜱的塔城蜱病毒1型(TcTV
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1)、钝刺血蜱的黄陂蜱病毒1型(HpTV
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1)及温州蜱病毒(WzTV)4个成员。早期，这些病毒对人或动物的危害未引起人们关注。2019年报道了一例人类感染TcTV
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1的病例，并从中国新疆的一名高热病综合征患者中分离出病毒颗粒，在当地人群中检测到抗TcTV
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1抗体，在家畜(牛和绵羊)和蜱虫中也发现了该病毒RNA，由此推测Tamdy基因型可对公共卫生构成传染性威胁。
[0004]TAMV是一种典型的布尼亚病毒，病毒粒子直径80～120nm，呈圆形或卵圆形，有脂质双层膜，表面具有5～10nm的糖蛋白突起。TAMV完整的基因组编码序列为单股负链RNA，由S、M、L三个片段组成，分别编码核衣壳蛋白NP、膜蛋白GP和RNA依赖的RNA聚合酶RdRp。2016～2017年从我国新疆部分地区采集的蜱虫样本进行乳鼠接种和高通量测序，从新疆尉犁地区的亚洲璃眼蜱(H.asiaticum)中检测并分离获得2株TAMV新毒株，两株TAMV具有高度序列相似性(99.95％～100％)，与Tamdy orthonairovirus的其他成员具有37％～59％的相似性，与CCHFV仅有34％～49％的相似性。基于RdRp、GP和NP基因序列的系统发育树都证实了TAMV与目前已知的TAMV毒株和Tamdy orthonairovirus其他成员的密切相关。研究还发现，TAMV对人、猴子、羊、狗、小鼠和蜱虫等动物来源细胞均具有感染敏感性，提示TAMV存在人和蜱虫生活相关的宿主动物之间潜在的感染风险。
[0005]蜱媒病毒(Tick
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borne virus,TBV)是一大类重要的虫媒病毒，由于TBV传播方式及宿主动物种类繁多，且TBV所致疾病早期往往缺乏特异的临床表现，导致人们对这一类疾病缺乏足够的认识，导致TBV在人类、家畜和野生动物广泛传播，严重危害着人类健康、畜牧业生产及野生动物生存。目前，由于蜱媒TAMV为新发传染病，还没有相应的抗原或抗体的检
测方法，对其病毒感染后的疾病谱及疫情未来的发展趋势评估等也无法展开研究，因此，需要建立一种价格低廉、快速、敏感且能简便检测血清样本的TAMV抗体的方法。理论上对于TAMV抗体检测可用全病毒包被的形式建立间接ELISA检测方法；也可以用针对NP/GP重组蛋白的特异性抗体建立的间接ELISA方法。但全病毒包被需大量病毒，成本高且存在散毒风险。单抗制备较为繁琐且费时费力，短期内不能完成。由于TAMV的NP是病毒体和感染细胞中最丰富的蛋白，NP是病毒诱导机体发生早期体液免疫和细胞免疫的主要抗原，具有免疫优势，在感染早期和恢复期也容易测到抗NP抗体，为疾病的诊断检测提供坚实的基础。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种特异性好，灵敏度高的TAMV核蛋白多抗原表位串联重组蛋白及其应用，该重组蛋白基于TAMV YL16082毒株核蛋白(GenBank登录号：MT815991)，经过改良生物合成肽法筛选鉴定NP蛋白的精细B细胞抗原表位，多拷贝串联抗原表位基因片段后利用原核表达系统表达获得，所示氨基酸序列为SEQ ID No.1所示，其对应的核苷酸序列为SEQ ID No.2。
[0007]本专利技术的第一方面，提供一种TAMV核蛋白多抗原表位串联重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0008]优选的，编码所述重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0009]本专利技术的第二方面，提供一种上述的TAMV核蛋白多抗原表位串联重组蛋白的制备方法，采用改良的生物合成肽法对TAMV毒株TAMV
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YL16082的NP蛋白进行线性B细胞表位(BCEs)鉴定，BCEs基因用柔性肽串联，并将其分别构建到原核表达载体pET
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32a(+)中。重组原核质粒pET
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32a
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NP
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MEPX4转化到E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达，SDS
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PAGE分析表达的r
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NP
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MEPX4重组蛋白大小，镍柱亲和层析纯化r
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NP
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MEPX4重组蛋白，Western blot法检测血清与r
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NP
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MEPX4重组蛋白的特异性反应能力。
[0010]优选的，包括以下步骤：
[0011]1)获得一种重组DNA，该重组DNA编码如SEQ ID No.1所示的蛋白质；
[0012]2)将步骤1)的重组DNA利用基因工程重组技术构建能够表达NP
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MEPX4的基因工程质粒pET
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32a
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NP
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MEPX4；
[0013]3)将质粒pET
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32a
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NP
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MEPX4转入宿主大肠杆菌BL21制备基因工程菌BL21(pET
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32a
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NP
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MEPX4)，将BL21(pET
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32a
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NP
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MEPX4)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种TAMV核蛋白多抗原表位串联重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。2.根据权利要求1所述的TAMV核蛋白多抗原表位串联重组蛋白，其特征在于，编码所述重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。3.根据权利要求1所述的TAMV核蛋白多抗原表位串联重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)获得一种重组DNA，该重组DNA编码如SEQ ID No.1所示的蛋白质；2)将步骤1)的重组DNA利用基因工程重组技术构建能够表达r
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NP
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MEPX4的基因工程质粒pET
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32a
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NP
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MEPX4；3)将质粒pET
‑
32a
‑
NP
‑
MEPX4转入宿主大肠杆菌BL21制备基因工程菌BL21(pET
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32a
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NP
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MEPX4)，将BL21(pET
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32a
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NP
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MEPX4)接种LB培养基中培养，利用IPTG诱导表达并进行条件优化，所表达的r
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NP
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MEPX4为重组蛋白主要呈包涵体表达；4)将表达的r
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NP
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MEPX4重组蛋白通过亲和层析镍柱进行纯化获得TAMV核蛋白多抗原表位串联重组蛋白。4.根据权利要求3所述的TAMV核蛋白多抗原表位串联重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤1)具体为：利用改良生物合成肽法筛选鉴定TAMV NP的B细胞抗原表位，多拷贝串联抗原表位，获得一种重组DNA，该重组DNA编码如SEQ ID No.1所示的蛋白质。5.根据权利要求4所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁军涛，王颖，孙素荣，美丽排提，
申请(专利权)人：新疆大学，
类型：发明
国别省市：